核酸的分子組成；

　　DNA的一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)及其功能；

　　幾種主要RNA(mRNA、tRNA)的結(jié)構(gòu)與功能；

　　DNA的理化性質(zhì)及應(yīng)用。

　　重點：DNA的二級結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點；DNA的變性復(fù)性特點及此特點在分子生物學(xué)中的應(yīng)用是。

　　基本知識與理論：

　　一、核酸的化學(xué)組成

　　核酸是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子。包括兩類：一類為脫氧核糖核酸（DNA），另一類為核糖核酸（RNA）。DNA存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，攜帶遺傳信息；RNA存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，參與細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的表達(dá)。核酸的基本組成單質(zhì)是核苷酸，而核苷酸又是由堿基、戊糖、磷酸組成。

　　(一)堿基

　　構(gòu)成核苷酸的堿基主要有五種，分屬嘌呤和嘧啶兩類。嘌呤類化合物包括腺嘌呤A和鳥嘌呤G兩種。嘧啶類化合物有三種，胞嘧啶C和胸腺嘧啶T尿嘧啶U。嘌呤和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵，因此對波長260nm左右的紫外光有較強吸收，這一性質(zhì)可用于對核酸、核苷酸、及堿基進(jìn)行定性定量分析。

　　(二)戊糖與核苷、核苷酸

　　戊糖是核苷酸的另一個主要成分，RNA和DNA主要區(qū)別有兩點：一是構(gòu)成DNA的堿基為A、T、G、C，而RNA的堿基為A、U、C、G，二是構(gòu)成DNA的核苷酸的戊糖是β-D－2-脫氧核糖，而構(gòu)成DNA的核苷酸的戊糖為β-D—核糖。即RNA糖環(huán)上2號碳原子處連的是-OH，而DNA此處連的是-H。表示堿基和糖環(huán)上各原子次序時，在堿基雜環(huán)上標(biāo)以順序1，2，3…；在糖環(huán)上標(biāo)以l′，2′，3′… 以作區(qū)別。堿基與戊糖通過糖苷鍵連接成核苷。連接位置是C-1′。核苷與磷酸通過磷酸酯鍵連接成核苷酸連接位置是C-5′。此處可連接一個、二個、三個磷酸基團(tuán)，稱為核苷一磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸。體內(nèi)還有一種核苷酸，即C-3′與C-5′與同一磷酸基團(tuán)相連，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。

　　二、DNA的結(jié)構(gòu)與功能

　　DNA與蛋白質(zhì)一樣，也有其一級、二級、三級結(jié)構(gòu)。

　?。ㄒ唬?DNA的一級法構(gòu)

　　指DNA分子中核苷酸的排列順序。由于核苷酸的差異主要表現(xiàn)在堿基上，因此也叫做堿基序列。

　　四種核苷酸按一定排列順序，通過磷酸二酯鍵連成主要核苷酸鏈，連接都是由前一核苷酸3′-OH與下一核苷酸5′-磷酸基形成3′-5′磷酸二酯鍵，故核苷酸鏈的兩個末端分別是5′-游離磷酸基和3′-游離羥基，書寫應(yīng)從5′到3′。

　?。ǘ〥NA的二級結(jié)構(gòu)

　　即雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，要與蛋白質(zhì)的α-螺旋相區(qū)別。

　　1．Chargaff規(guī)則

　　DNA分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶的含量相等，鳥嘌呤與胞嘧啶的含量相等；因此DNA中嘌呤與嘧啶的總數(shù)相等：即A＋G=C＋T

　　2．雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

　　1953年Watson和Crick正式提出了關(guān)于DNA二級結(jié)

　　構(gòu)的右手雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，主要內(nèi)容有：

　?。?）DNA分子由兩條反向平行的多聚核苷酸鏈圍繞同

　　一中心軸盤曲而成，兩條鏈均為右手螺旋，鏈呈反平行走向，一條走向是5′→3′，另一條是3′→5′。

　?。?）DNA鏈的骨架由交替出現(xiàn)的親水的脫氧核糖基和磷酸基構(gòu)成，位于雙螺旋的外側(cè)，堿基配對位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)。

　?。?）兩條多聚核苷酸鏈以堿基之間形成氫鍵配對而相連，即A與T配對，形成兩個氫鍵，G與C配對，形成三個氫鍵。堿基相互配對又叫堿基互補。RNA中若也有配對區(qū)，A是與U以兩個氫鍵配對互補。

　　(4)堿基對平面與螺旋軸幾乎垂直，相鄰堿基對沿軸轉(zhuǎn)36°，上升0．34nm。每個螺旋結(jié)構(gòu)含10對堿基，螺旋的距為3．4nm，直徑是2．0nm。DNA兩股鏈之間的螺旋形成凹槽：一條淺的，叫小溝；一條深的，叫大溝。大溝是蛋白質(zhì)識別DNA的堿基序列發(fā)生相互作用的基礎(chǔ)，使蛋白質(zhì)和DNA可結(jié)合而發(fā)生作用。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)要與pr的相區(qū)別：DNA是兩條核苷酸鏈通過堿基之間氫鍵相連而成，而蛋白質(zhì)的α-螺旋是一條肽鏈自身盤曲而成，其氫鍵是其內(nèi)部第1位肽鍵的N-H與第四個肽鍵的羰基氧形成的。

　　（5）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由互補堿基對之間的氫鍵和堿基堆積力來維持。堿基堆積力是堿基對之間在垂直方向上的相互作用，可以使DNA分子層層堆積，分子內(nèi)部形成疏水核心，這對DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是很有利的，堿基堆積力對維持DNA的二級結(jié)構(gòu)起主要作用。

　　3．DNA結(jié)構(gòu)的多樣性

　　DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA分子在水性環(huán)境和生-理條件下-穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，但并不是不變的，當(dāng)改變?nèi)芤旱碾x子強度或相對濕度時，DNA結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，除了Waston－Crick模型（B－DNA）外，還存在Z－DNA和A－DNA

　　（三）DNA三級結(jié)構(gòu)

　　真核生物DNA分子很大，DNA鏈很長，但卻要存在于小小的細(xì)胞核內(nèi)，因此DNA必須在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上緊密折疊，這就形成了三級結(jié)構(gòu)。

　　1超螺旋——原核生物DNA的三級結(jié)構(gòu)

　　絕大部分原核生物DNA是共價閉合的環(huán)狀雙螺旋分子，此環(huán)形分子可再次螺旋形成超螺旋，真核生物線粒體、葉綠體DNA也為環(huán)形分子，能形成超螺旋，非環(huán)形DNA分子在一定條件下局部也可形成超螺旋。

　　2.真核細(xì)胞基因組DNA

　　真核細(xì)胞核內(nèi)染色體即是DNA高級結(jié)構(gòu)的主要表現(xiàn)形式。組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成組蛋白八聚體。DNA雙螺旋纏繞其上構(gòu)成核心顆粒，顆粒之間再以DNA和組蛋白H1連成核小體，核小體再經(jīng)多步旋轉(zhuǎn)折疊形成棒狀染色體，存在于細(xì)胞核中。

　　(四)DNA的功能

　　DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板，是生命遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的基礎(chǔ)。

　　三、RNA的結(jié)構(gòu)與功能

　　RNA通常以單鏈形式存在，這與DNA雙鏈形成螺旋不同，但也可以有局部的二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)。RNA分子比DNA分子小，它的功能多樣，種類較多，主要有信使RNA、核蛋白體RNA、轉(zhuǎn)運RNA、小核RNA及核不均一RNA等。各類RNA在遺傳信息表達(dá)為氨基酸序列過程中發(fā)揮不同的作用。

　?。ㄒ唬┬攀筊NA（mRNA）

　　在細(xì)胞核內(nèi)以DNA單鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成hnRNA,hnRNA經(jīng)過剪切變?yōu)槌墒斓膍RNA,出核后在胞質(zhì)內(nèi)為蛋白質(zhì)合成提供模板。成熟mRNA的結(jié)構(gòu)特點：

　　1具有5′端帽子結(jié)構(gòu)

　　即在5′端加上一個7-甲基鳥苷；且原來第1個核苷酸C２′也是甲基化，這種mGpppGm即為帽子結(jié)構(gòu)，

　　2. 3′端多聚腺苷酸尾

　　在mRNA3′端有一段多聚腺苷酸節(jié)段，是在轉(zhuǎn)錄后切掉一段多余的RNA后逐個添加上去的，這個多聚尾可能與mRNA從核內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位及mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。

　　3生物體內(nèi)mRNA種類多，含量少，代謝活躍，在各種RNA分子中，mRNA半衰期短，這是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成速度的調(diào)控點之一。

　　(二)核蛋白體RNA(rRNA)的結(jié)構(gòu)與功能

　　rRNA是細(xì)胞內(nèi)含量多的RNA，與核糖體蛋白共同構(gòu)成核糖體——蛋白質(zhì)的合成部位，參與蛋白質(zhì)的合成。核蛋白體由大亞基和小亞基組成。

　　1.原核生物：小亞基由16SrRNA和20多種蛋白質(zhì)組成。

　　大亞基由5S、23SrRNA與30余種蛋白質(zhì)組成。

　　2.真核生物：小亞基由18SrRNA與30余種蛋白質(zhì)組成。

　　大亞基由5S、5.8S、28SrRNA和近50種蛋白質(zhì)構(gòu)成。

　　(三)轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)的結(jié)構(gòu)與功能

　　1.tRNA的一級結(jié)構(gòu)

　　tRNA是細(xì)胞內(nèi)分子量小的一類核酸，含有大量稀有堿基：如甲基化的嘌呤、雙氫尿嘧啶、次黃嘌呤和假尿嘧啶核苷。假尿嘧啶核苷與一般的嘧啶核苷區(qū)別在于以雜環(huán)上C-5而非N-1與糖環(huán)C-1′

　　連成糖苷鍵。tRNA的作用是攜帶相應(yīng)的氨基酸將其轉(zhuǎn)運到核蛋白體上以供蛋白質(zhì)合成。

　　2.tRNA的二級結(jié)構(gòu)

　　呈三葉草樣二級結(jié)構(gòu)：一些能局部互補配對的區(qū)域形成局部對鏈，不能配對的部分膨出成環(huán)狀。此結(jié)構(gòu)從5′末端起第1個環(huán)為二氫尿嘧啶環(huán)（Tφ），第二個環(huán)為反密碼子環(huán)，因其環(huán)中部的三個堿基可與mRNA中三聯(lián)體密碼子形成堿基互補配對，在蛋白質(zhì)合成過程中解讀密碼子，把正確的氨基酸引入合成位點。第三個環(huán)為假尿嘧啶環(huán)（DHU），所有tRNA3′末端為CCA-OH結(jié)構(gòu)，與氨基酸在此縮合成氨基酰-tRNA，起到轉(zhuǎn)運氨基的作用。

　　3．tRNA的三級結(jié)構(gòu)

　　tRNA的三級結(jié)構(gòu)呈倒L形，T與DHU在二級結(jié)構(gòu)上各處一方，但在三級結(jié)構(gòu)上卻相距很近，維系tRNA三級結(jié)構(gòu)主要是依賴核苷酸之間形成的各種氫鍵。

　　（四）其他類型的RNA

　　如小核RNA（snRNA）參與hnRNA的加工。還有一類RNA分子本身具有自我催化功能，可完成rRNA的剪接。這種具有催化作用的RNA被稱為核酶。要與核酸酶區(qū)別，后者是指可水解核酸的酶，故按照底物不同可分為DNA酶和RNA酶。

　　四、核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用

　?。ㄒ唬┖怂岬囊话憷砘再|(zhì)

　?、俸怂釣槎嘣幔哂休^強的酸性。②DNA是線性高分子，粘度極-大，在機械力作用下易斷裂，因此提取DNA過程中應(yīng)注意不能過度用力，比如劇烈震蕩吹打等。③由于核酸所含的嘌呤和嘧啶分子中都有共軛雙鍵，使核酸分子在紫外260nm波長處有大吸收峰，這個性質(zhì)可用于核酸的定量測定。這要與pr在280mm波長處有大的吸收峰相區(qū)別，又因為分子生物學(xué)實驗核酸提取過程中，蛋白質(zhì)是-常見的雜質(zhì)，故常用UD260/UD280來檢測提取的核酸純度如何。

　　（二) DNA的變性、復(fù)性和雜交

　　1．變性，這是DNA重要的一個性質(zhì)。

　?、貲NA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即為DNA變性。DNA變性只涉及二級結(jié)構(gòu)改變，不伴隨一級共價鍵的斷裂。②監(jiān)測DNA是否變性的一個-常用的指標(biāo)是DNA在紫外區(qū)260nm波長處的吸收光值變化。因為DNA變性時，DNA雙鏈發(fā)生解離，共軛雙鍵更充分暴露，故DNA變性，DNA在260nm處的吸收光度值增加，并與解鏈程度有一定的比例關(guān)系，這種關(guān)系叫做DNA的增色效應(yīng)。③DNA的變性從開始到解鏈*，是在一個相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值增加達(dá)到大增加值的50％時的溫度叫做DNA的解鏈溫度（Tm）。一種DNA分子的 Tm值的大小與其所含堿基中的 G＋C的比例相關(guān)也與DNA分子大小及變性條件有關(guān)，G+C的比例越高，DNA分子越長，溶液離子強度越高，Tm值越大。④加熱、低鹽及強酸、強堿均可使DNA變性。

　　2．復(fù)性

　　變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條互補鏈可重新恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這種現(xiàn)象稱為復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程也叫退火，一般認(rèn)為，比Tm值低25℃的溫度是DNA復(fù)性的-佳條件。

　　3．DNA復(fù)性的實際應(yīng)用——雜交：通過變性DNA的復(fù)性性質(zhì)，我們可知道，DNA單鏈之間、RNA單鏈之間、一條DNA和一條RNA鏈之間只要存在序列互補配對區(qū)域，不管是整條鏈互補，還是部分序列互補，即可重新形成整條雙鏈或部分雙鏈，這即為核酸分子雜交，這在分子生物學(xué)研究中有極-大的應(yīng)用，比如：可用于在基因組中對特異基因的定位及檢測，PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因等，很多分子生物學(xué)實驗技術(shù)應(yīng)用的都是核酸分子雜交的原理，如Southern Blot, Northern Blot,包括PCR技術(shù)等。

　　五、核酸酶

　　指水解核酸的酶，根據(jù)底物不同分DNA酶、RNA酶，根據(jù)作用位點不同分核酶外切酶和核酸內(nèi)切酶，其中限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用尤為重要。