我們可能都有過這樣的經(jīng)歷：

    辛苦呵護(hù)的細(xì)胞，怎么也不愿意貼壁；

    貼壁了又很容易成塊或者成團(tuán)掉下來；

    原本貼壁的細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞不貼壁了；

    ........

遇到這樣的問題你都如何解決？這次我們就來聊聊，為啥你的細(xì)胞為這么矯情，不愿貼壁呢？

體外培養(yǎng)細(xì)胞貼壁與什么有關(guān)？

首先并不是所有的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下都會貼壁，但大部分來自實體組織器官的細(xì)胞都會貼壁。

貼壁的過程可能是這樣的：細(xì)胞首先分泌細(xì)胞外基質(zhì)，這種細(xì)胞外基質(zhì)黏附在支持物的表面（培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面）。然后，細(xì)胞通過其表面表達(dá)的黏附因子與這些細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。

所以細(xì)胞貼壁與否和細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞本身表達(dá)的黏附分子的數(shù)量有關(guān)，也與培養(yǎng)皿壁的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。

 

細(xì)胞為什么要貼壁？

細(xì)胞貼壁的過程使形態(tài)發(fā)生很大變化，細(xì)胞形態(tài)改變是細(xì)胞內(nèi)骨架（是真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系，由微管、微絲及中間纖維組成的體系）本身和細(xì)胞外基質(zhì)共同作用的結(jié)果。

密度大于培養(yǎng)基的細(xì)胞（絕大部分細(xì)胞）會沉降在底面上，那么細(xì)胞要生存必定得改善這個環(huán)境，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，改善底面的結(jié)構(gòu)，然后很自然就貼附在底面上了。

密度小于水的細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞，漂浮在液面上，所以不可能貼在底面上，但是如果將培養(yǎng)液加滿，那么細(xì)胞能夠與培養(yǎng)瓶上面的壁接觸同樣可以貼壁。因此可以說，細(xì)胞貼壁是適應(yīng)環(huán)境的一種反應(yīng)。

細(xì)胞不貼壁，可能是這些原因？

    細(xì)胞的傳代zui重要的是胰酶處理時間：消化不夠細(xì)胞本身就是成團(tuán)的；若胰酶處理太久，容易造成細(xì)胞膜蛋白損傷，使細(xì)胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強(qiáng)，嚴(yán)重的時候甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡。

    缺少貼壁因子：血清中含有促貼壁因子，而無血清培養(yǎng)基工藝中由于缺少這種促貼壁因子，細(xì)胞的貼壁效果會下降很多。

    支原體或細(xì)菌的污染。

    培養(yǎng)液配置、儲存不當(dāng)，如 pH 值過堿，Gln 量太少等原因。

    復(fù)蘇的細(xì)胞本身狀態(tài)不好，已經(jīng)老化，失去貼附性。

    接種細(xì)胞數(shù)目太少，無法分泌足夠的細(xì)胞外基質(zhì)。

    復(fù)蘇時處理速度太慢，復(fù)蘇過程不當(dāng)。

如何促進(jìn)貼壁效果？

1. 適度消化細(xì)胞：HepG- 2、A549、Hela、SGC- 7901 幾種癌細(xì)胞處理時間可適當(dāng)放長，一般處理 5 - 6 min，C2C12、COS- 7、NIH- 3T3 比較容易脫落，2 min 足矣，P19Cl6 和 293 細(xì)胞貼壁不緊，可在 PBS 漂洗后，直接換新鮮培養(yǎng)基打散。

2. 用塑料瓶培養(yǎng)，如果是玻璃瓶, 那么可以用鼠尾膠原包被一下培養(yǎng)瓶，或者用鹽酸對培養(yǎng)瓶進(jìn)行蝕刻，或者涂 Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以幫助細(xì)胞貼附新的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞不易貼壁，建議加多聚賴氨酸處理。

3. 正確配制消化液或培養(yǎng)液。

4. 使用合適的細(xì)胞外基質(zhì)或貼壁試劑。

5. 復(fù)蘇新的細(xì)胞，*周用 20% 血清幫助細(xì)胞復(fù)原。

6. 傳代接種一定要鋪的均勻，避免細(xì)胞抱團(tuán)生長。

7. 細(xì)胞傳代 24 小時之內(nèi)，不要晃動，以免影響貼壁。

8. 體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜上，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上有利于生長。人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)，可以用γ射線照射后的 3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層，另外降低 pH、Ca2 +含量和溫度，均有利于上皮細(xì)胞生長。