全轉(zhuǎn)錄組這么火，怎么做？小編帶您一文參透全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究套路！

一、什么是全轉(zhuǎn)錄組？

全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出的所有轉(zhuǎn)錄本信息的總和，包含mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA等編碼和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為科學(xué)研究的基礎(chǔ)，其研究意義的重要性*。近年來，除了魅力不減當(dāng)年的miRNA、炙手可熱的lncRNA外，ceRNA分析也開始嶄露頭角，成為科研界的耀眼明星。

二、為什么做全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序？

想解答這個(gè)問題，咱們先來聊聊什么是ceRNA。

ceRNA (competing endogenousRNA，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA) 并不是新的RNA分子，而是一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，ceRNA假說揭示了一種RNA間相互作用的新機(jī)制。

ceRNA—競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA

mRNA或ncRNA上存在可被miRNA結(jié)合的區(qū)域，即MREs功能元件，包含同源MREs的RNA分子可競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合miRNA。已知miRNA可通過結(jié)合靶基因?qū)е禄虺聊詂eRNA可以通過競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA來調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]。

目前，單一的mRNA或ncRNA研究已不能滿足科研需求，結(jié)合多種RNA信息進(jìn)行ceRNA聯(lián)合分析，探究其潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制已成為解釋生物學(xué)現(xiàn)象的利器！

三、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序怎么做？

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序即應(yīng)用RNA-seq技術(shù)，通過構(gòu)建兩種文庫—小RNA文庫和去核糖體的鏈特異性文庫，可一次性分析4種RNA (miRNA，lncRNA，mRNA，circRNA) 信息。

3.1分析內(nèi)容

全轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容更全面，除4種RNA標(biāo)準(zhǔn)分析外，還包含ceRNA聯(lián)合分析，更可附贈(zèng)高級(jí)分析內(nèi)容，*超優(yōu)惠！

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息分析流程

ceRNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[2]

3.2 研究思路

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究思路

1）確定研究對(duì)象
對(duì)照組&處理組；健康組&疾病組；癌組織&癌旁組織……
2）應(yīng)用RNA-seq獲得4種RNA數(shù)據(jù)
3）篩選差異表達(dá)的mRNA，lncRNA，miRNA，circRNA
4）構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選ceRNA-mRNA調(diào)控pairs
5）QRT-PCR驗(yàn)證其表達(dá)量相關(guān)性
6）ceRNA調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證
a. 從蛋白水平、RNA水平等驗(yàn)證ceRNA對(duì)靶標(biāo)基因的作用；
b. 分析miRNA結(jié)合位點(diǎn)，ceRNA-miRNA調(diào)控關(guān)系；
7）功能驗(yàn)證
a. 細(xì)胞水平：細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡及周期變化，腫瘤轉(zhuǎn)移等；
b. 分子水平：Western Blot和免疫組化，siRNA干擾/過表達(dá)載體，免疫沉淀（IP）等；
c. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建動(dòng)物模型，腫瘤模型；
d. 臨床層面：檢測(cè)動(dòng)物表型及生化指標(biāo)變化，術(shù)后恢復(fù)情況。

3.3 案例解析

實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯1標(biāo)準(zhǔn)，文章是總結(jié)思路的一da法寶！近期發(fā)表在Nature communications的兩篇文章，分別以lncRNA，circRNA為主要研究點(diǎn)，結(jié)合mRNA，miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行ceRNA分析，探究其調(diào)控機(jī)制。

1. 前列腺癌中l(wèi)ncRNA介導(dǎo)的sponge調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[3]

研究表明，lncRNA可作為miRNA海綿競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mRNA。文章通過生物信息學(xué)分析篩選到2個(gè)sp-lncRNA，并確定PTEN為其調(diào)控基因，通過miRNA發(fā)揮作用，從而表明lncRNA介導(dǎo)的海綿調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在癌癥調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

2. circRNA的miRNA海綿作用機(jī)制[4]

文章應(yīng)用RNA-seq技術(shù)篩選差異circRNAs，確定circHIPK3為目標(biāo)分子，并進(jìn)行鑒定及生成、胞nei定位等研究；通過miRNA結(jié)合位點(diǎn)分析并結(jié)合多重實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明circHIPK3可作為miRNA海綿發(fā)揮調(diào)控作用。