近年來，隨著檢測(cè)參數(shù)越來越多，流式細(xì)胞儀也日漸普及。不過，盡管多個(gè)參數(shù)同時(shí)分析可帶來大量信息，但在樣品制備過程中必須采取適當(dāng)?shù)拇胧?，才能保證流式數(shù)據(jù)是相關(guān)的。如何才能少走彎路，下面聽聽各位專家的建議。

1. 從采集那一刻開始

流式分析所用的樣品是十分多樣化的，從細(xì)胞、血液到組織等。這些需要不同的樣品采集和處理方法。“血液或組織樣品通常在分析前幾天、幾周甚至幾個(gè)月采集，比如大型隊(duì)列研究，”美天旎的產(chǎn)品經(jīng)理Johannes Fleischer解釋說，“若保存不當(dāng)，可能會(huì)影響結(jié)果。為了實(shí)現(xiàn)高度標(biāo)準(zhǔn)化，建議使用專門的組織保存試劑、冷凍干燥或保存在-80℃，以減少實(shí)驗(yàn)可變性。”

2. 是否需要富集細(xì)胞？

BioLegend的技術(shù)服務(wù)專家Ekaterina Zvezdova表示：“通常，人們利用抗體或細(xì)胞因子等刺激物處理后，使用流式細(xì)胞儀來評(píng)估細(xì)胞的活化狀態(tài)。然而，對(duì)細(xì)胞的刺激往往會(huì)導(dǎo)致表面受體內(nèi)化。例如，抗CD3抗體對(duì)T細(xì)胞的刺激導(dǎo)致T細(xì)胞表面的TCR/CD3復(fù)合物下調(diào)，因此無法通過CD3或TCR分子來鑒定異質(zhì)群體中的T細(xì)胞。”

他認(rèn)為，研究人員需要預(yù)測(cè)不同處理方式對(duì)特定細(xì)胞標(biāo)志物的影響，從而制定有效的策略來收集數(shù)據(jù)。比如，在細(xì)胞鑒定時(shí)采用替代性的譜系標(biāo)志物，或者在刺激之前就富集感興趣的細(xì)胞亞群。

Fleischer也強(qiáng)調(diào)了富集細(xì)胞的好處。他解釋說，稀有細(xì)胞，比如循環(huán)腫瘤細(xì)胞、造血干細(xì)胞和抗原特異性T細(xì)胞，在流式實(shí)驗(yàn)中是很難捕獲的。“使用與抗體偶聯(lián)的磁珠，可以富集這些稀有細(xì)胞，”他說。美天旎的MACSQuant Analyzer流式細(xì)胞儀可與磁性富集柱相整合，從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的細(xì)胞富集。

3. 解離細(xì)胞有何影響？

*，流式分析需要單細(xì)胞懸液，因此當(dāng)研究人員分析實(shí)體組織的細(xì)胞時(shí)，首先需要解離樣品。機(jī)械解離和酶解消化都是常用的方法，但兩者都會(huì)引起細(xì)胞應(yīng)激，并導(dǎo)致細(xì)胞存活率不高。

“為了提高重復(fù)性，我們開發(fā)出GentleMACS?解離設(shè)備，這種自動(dòng)化的儀器帶有預(yù)先設(shè)好的程序，可以更溫和地解離特定的生物材料，”Fleischer解釋說。“我們還設(shè)計(jì)出一系列組織特異性的解離緩沖液，作為GentleMACS設(shè)備的補(bǔ)充。我們已經(jīng)生成了大量的測(cè)試數(shù)據(jù)，證明它們可以更好地保留細(xì)胞表面的表位。”

Zvezdova也指出，酶解消化往往會(huì)影響抗體結(jié)合的表位。“例如，貼壁細(xì)胞經(jīng)過胰蛋白酶處理會(huì)導(dǎo)致鈣粘蛋白的切割和失活，使得對(duì)應(yīng)的抗體難以識(shí)別其靶點(diǎn)。為了減少這些影響，使用更溫和的解離溶液是明智之舉，如Accutase?。”

無論采用哪種形式的解離，F(xiàn)leischer都建議使用細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，以去除樣品中的團(tuán)塊。“大多數(shù)研究人員在流式分析中都遇到過進(jìn)樣管堵塞的痛苦時(shí)刻，而細(xì)胞濾網(wǎng)是避免堵塞和外溢的關(guān)鍵工具，”他說。

4. 固定也需要優(yōu)化

固定這個(gè)步驟也會(huì)影響抗體結(jié)合表位。一些抗體用于固定細(xì)胞染色時(shí)表現(xiàn)出信號(hào)損失。“我們對(duì)一些抗體克隆進(jìn)行了內(nèi)部測(cè)試，比較了未固定的細(xì)胞以及染色前用4%多聚甲醛固定的細(xì)胞，”Zvezdova說。“這些結(jié)果顯示了固定表位的染色是否有可能成功，如果您的抗體克隆未提供相關(guān)信息，我們通常建議在固定細(xì)胞前進(jìn)行表面染色。”

溫度也會(huì)明顯影響抗體結(jié)合，導(dǎo)致趨化因子和細(xì)胞因子受體等表面蛋白的快速內(nèi)化。如果要在固定前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，那么在室溫或37℃下進(jìn)行抗體孵育，而不是4℃。

5. Fc封閉可降低背景

抗體與免疫細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合是造成背景染色的主要原因，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果，或掩蓋低豐度靶點(diǎn)的存在。因此，在開展免疫染色之前，加入Fc封閉步驟。“盡管使用Fc封閉試劑可減少背景染色，但這會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)操作中多了一步，并可能造成細(xì)胞損失，”Fleischer指出。

“為了讓Fc封閉不再成為必需，我們開發(fā)出了REAfinity?重組抗體。這些抗體的Fc區(qū)域經(jīng)過改造，不再與Fc受體結(jié)合，能夠產(chǎn)生一致性更好的流式分析數(shù)據(jù)，”他說。

6. 巧用活細(xì)胞染料

Nanna Therapeutics的科學(xué)家Catherine Klapholz認(rèn)為：“在樣品制備過程的多個(gè)階段進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確認(rèn)未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞損失，這是一種明智的做法。活細(xì)胞染料可提供有用的信息，告知不同的制備技術(shù)對(duì)整個(gè)細(xì)胞群的影響。不過，必須測(cè)試染色的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)采集有時(shí)需要1-2小時(shí)，并且是在室溫甚至4℃下，則信號(hào)有可能會(huì)急劇增加。”

無論我們對(duì)樣品制備過程采用多么精心的優(yōu)化，但適用于A細(xì)胞的方案不一定適用于B細(xì)胞，正所謂“甲之蜜糖，乙之pi霜”。只有為每種細(xì)胞量身定制不同的樣品制備方案，我們的流式細(xì)胞分析才有可能獲得成功。