PCR 是一個坑，坑里埋了好多研究僧……

PCR 是眾位「研究僧」日常實驗中常用的技術(shù)，可謂是「研究盛宴」中的一道「小菜」?？梢灿胁簧偻从常@道菜不hao吃，一不小心就「小河里翻船」。

那么，我們該如何把這道菜「吃好」、跳出這個「坑」呢？
 

諸位看官莫急，待我送君「三大fa寶」。

一、確保 RNA 樣本合格

常見的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法，這兩個方法各有所長，但都不能保證提取的 RNA 樣本一定合格。

因而，提取完成后應(yīng)測定 RNA 的濃度及吸光度。通常，在 260，280，230 nm 處分別測定其吸光度（A260、A280、A230）并計算其比值（A260 /A280，A260 /A230）。

那么，這幾個數(shù)值及其比值分別有何意義？
 

A260 為核酸的吸光度，A280 為蛋白質(zhì)的吸光度，A230 為其他雜質(zhì)（多糖等）的吸光度。純 DNA 的 A260 /A280 為 1.8，純 RNA 的 A260 /A280 為 2.0。

如果 OD 比值不在范圍內(nèi)該如何解決呢？

再次洗滌樣本！
 

75% 乙醇沉淀 RNA 后重新吸附、洗滌；若采用 TRIzol 法提取 RNA，可直接洗滌兩次。洗滌后離心時可兩次分別將 EP 管置于不同的方向，便于*洗滌 RNA 樣本。通常洗滌兩次后可使測得的 OD 值較為理想。

二、 利用「RNAstructure」軟件

引物，是進(jìn)行熒光定量實驗的*條件。其特異性的問題可通過「BLAST」搞定，讓人比較頭痛的是引物可以形成「發(fā)夾結(jié)構(gòu)」或「二聚體」（即在＜75℃ 時出現(xiàn)溶解曲線的峰），影響擴(kuò)增效率，終導(dǎo)致實驗結(jié)果不可用。

那么，這個問題能否解決呢？
 

有！設(shè)計引物的時候用「RNAstructure」預(yù)測一下引物的二級結(jié)構(gòu)即可。

那么，這個軟件要如何使用呢？
 

1. 打開「RNAstructure」，單擊左上角的「new sequence」按鈕：

2. 新建序列文件，會出現(xiàn)一個對話框，輸入待檢測的引物序列：

3. 單擊「Fold as DNA」，「save changes」，出現(xiàn)新的對話框后直接點擊「Start」：

4. 無需更改其他參數(shù)，再次點擊「Draw structure」，即可得到目標(biāo)序列的二級結(jié)構(gòu)：

• 若考察引物能否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，則直接檢測 Forward 或 Reverse 引物即可。

• 若考察引物能否形成二聚體，則把兩條引物一起輸入，視作一條序列進(jìn)行檢測即可。

在得到二級結(jié)構(gòu)圖后，只要沒有連續(xù) 4 個以上的配對即可；若一條引物長度為 20 bp，在 18～22 處有連續(xù) 5 個的堿基配對，則可「手動拆解配對」，即保證引物為兩條鏈時的配對不多于 4 個即可。
 

三、保證擴(kuò)增效率符合要求

有童鞋反映，兩個同類基因測試同一批樣本，理論上趨勢應(yīng)該一致，結(jié)果卻是兩種趨勢，應(yīng)該相信哪個呢？

不知道各位看官有沒有遇到類似的問題？這類問題該如何解決呢？

先說說出現(xiàn)這類問題的原因吧：

1. 擴(kuò)增條件非*；

2. 樣本中含有抑制擴(kuò)增的物質(zhì)，如乙醇。

一對引物有其特定的 Tm 值，但 Tm 值時未必是其*擴(kuò)增溫度。溫度過高時，擴(kuò)增效率過低，差異部分的目的基因不能被擴(kuò)增，導(dǎo)致「假陰性」結(jié)果的出現(xiàn)。

那么，如何確定擴(kuò)增效率是否滿足要求呢？

通常，拿到新引物后應(yīng)從 Tm- 5℃ 尋找其適宜的擴(kuò)增溫度，在某溫度起為特異性擴(kuò)增。

然后，在特異性擴(kuò)增的溫度下檢測擴(kuò)增效率：將 cDNA 梯度稀釋（一般為 2×），測試稀釋后的樣本 Ct 值差異是否為 1 左右。

• 若差值為 1，則擴(kuò)增效率良好，可進(jìn)行正式實驗。

• 若在特異性擴(kuò)增的溫度范圍內(nèi)不能使 Ct 值差異為 1，則需考慮重新設(shè)計引物。