無論是什么藥物在人體中起作用都分兩步：delivery和function。我們所說的細(xì)胞＆基因治療更加需要的delivery和強(qiáng)大的function。如何將目的基因或者細(xì)胞安全有效地傳送到人體內(nèi)成為細(xì)胞和基因治療個(gè)要突破的重要瓶頸。今天我們就來簡單總結(jié)一下各個(gè)重要載體的異同。

病毒和非病毒載體

目前的基因&細(xì)胞治療主要采用病毒和非病毒兩種載體形式。根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用非病毒載體進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的項(xiàng)目大約占目前基因&細(xì)胞治療總數(shù)量的36.6%；其主要載體形式有質(zhì)粒和脂質(zhì)體等。而大部分的基因&細(xì)胞治療項(xiàng)目都是采用病毒作為載體形式。

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圖1：1989-2017年間臨床實(shí)驗(yàn)中所用到的各種載體的個(gè)數(shù)及占比。（圖片來源：The Journal of Gene Medicine）

非病毒載體

脂質(zhì)體：

1987年，F(xiàn)elger首先使用脂質(zhì)體作為載體介導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體一般帶有極性疏水基團(tuán)，該基團(tuán)能夠保證脂質(zhì)體分散在水介質(zhì)中形成雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)將氨基酸基團(tuán)暴露于水介質(zhì)中。脂雙層結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的雙層膜結(jié)構(gòu)類似，有利于脂質(zhì)體復(fù)合物經(jīng)過細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞。個(gè)被批準(zhǔn)作用于人體的脂質(zhì)體是DC-Chol/DOPE。大多數(shù)應(yīng)用于基因治療的脂質(zhì)體都是陽離子脂質(zhì)體。其優(yōu)點(diǎn)是自身帶有的正電荷更有利于通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，可以在近端腫瘤組織中高表達(dá)。但是由于脂質(zhì)體本身代謝時(shí)間較快，很難表達(dá)在遠(yuǎn)端腫瘤細(xì)胞中。同時(shí)，有研究指出陽離子脂質(zhì)體具有細(xì)胞毒性，因此其在基因/細(xì)胞治療中的安全性也應(yīng)重點(diǎn)考慮。

裸質(zhì)粒：

使用裸質(zhì)粒作為載體是基因治療常用的手段之一。截止到2017年，范圍內(nèi)使用裸質(zhì)粒作為載體的基因治療臨床試驗(yàn)共有442個(gè)。與病毒載體相比，裸質(zhì)粒在安全性上更有優(yōu)勢，比如其免疫原性、毒性更低，同時(shí)不存在基因整合的風(fēng)險(xiǎn)。另外，質(zhì)粒的生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存的成本也較低，更有利于商業(yè)化生產(chǎn)開發(fā)。但是由于質(zhì)粒本身的順轉(zhuǎn)體系問題，其穩(wěn)定性遠(yuǎn)不如病毒載體體系，從而制約了質(zhì)粒作為載體的有效性。

病毒載體

圖2：近年來，使用慢病毒及腺相關(guān)病毒的進(jìn)行基因/細(xì)胞治療的比例大幅上升。（數(shù)據(jù)來源：clinical trials）

逆轉(zhuǎn)錄病毒：

逆轉(zhuǎn)錄病毒是單鏈RNA病毒，在宿主細(xì)胞內(nèi)直接被當(dāng)做mRNA合成早期蛋白，同時(shí)依賴RNA聚合酶合成雙鏈，再轉(zhuǎn)錄成后來的致病mRNA。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠隨機(jī)插入宿主細(xì)胞基因組并穩(wěn)定整合，它被廣泛用于基因治療中，并取得很大的成功。但其缺點(diǎn)也很明顯。由于其傾向于插入基因個(gè)內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，它相對(duì)慢病毒更容易引起插入性隨機(jī)突變。在1997年，倫敦醫(yī)生嘗試用逆轉(zhuǎn)錄病毒，莫羅尼小鼠白血病病毒，治療X染色體上的IL2RG基因突變?nèi)毕輰?dǎo)致的X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID-X1），然而，由于其插入和破壞的基因變成了人類基因LMO2(LIM domain only 2)導(dǎo)致基因的異常激活，從而引發(fā)數(shù)例白血病。這次的事件也與1999年腺病毒治療Jesse Gelsinger導(dǎo)致死亡的事件一齊成為基因治療歷*的兩大事故。這兩起悲劇*不提示人們對(duì)于病毒載體安全性的思考和關(guān)注。

慢病毒：

相比之下，慢病毒因無嚴(yán)重的臨床事故出現(xiàn)成為目前安全的病毒載體選擇之一。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，但擁有比γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒更為復(fù)雜的基因組。來源上來說，慢病毒分為人免疫缺陷病毒（HIV-1），猴免疫缺陷病毒（SIV）和馬傳染性貧血病毒（EIAV）三種。目前使用較多的是來源于HIV的慢病毒載體。慢病毒載體具有能感染非分裂期細(xì)胞、容納外源性目的基因片段大、穩(wěn)定性強(qiáng)、免疫原性小等特點(diǎn)。大量研究表明，相對(duì)其他病毒載體，慢病毒感染效率高，更容易感染一些較難感染的組織和細(xì)胞，其效率一般可以達(dá)到30%-95%以上。相比于腺病毒以及腺相關(guān)病毒，慢病毒容量更大，能攜帶更大、更復(fù)雜的基因組，并且具有整合轉(zhuǎn)基因到宿主基因組的能力使產(chǎn)物穩(wěn)定和*的表達(dá)。

目前我們使用的慢病毒載體包裝系統(tǒng)將gag、pol基因與rev或env基因分別構(gòu)建在不同的質(zhì)粒上，并且在病毒基因組的3'LTR引入缺失以產(chǎn)生自失活（SIN）慢病毒載體，破壞LTR的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子活性，進(jìn)一步提高了安全性，并降低致癌風(fēng)險(xiǎn)。

所以，對(duì)于目前的基因/細(xì)胞治療來說，慢病毒通常是首xuan的載體之一。尤其是在CAR-T治療領(lǐng)域，慢病毒的應(yīng)用非常普及，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他載體。

腺相關(guān)病毒：

腺相關(guān)病毒（AAV）作為安全的病毒載體之一也是早用于基因治療的病毒載體。2016年2月，AAV載體制造之父，賓夕法尼亞州大學(xué)基因治療研究所的James Wilson 教授利用AAV治療罕見代謝尿素循環(huán)系統(tǒng)障礙。該病是由鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（OTC）缺失導(dǎo)致的。當(dāng)該酶系中一種酶丟失或者缺陷，氨就會(huì)積累在血液中，循環(huán)至大腦，終嚴(yán)重?fù)p傷大腦。據(jù)報(bào)道每40000名出生嬰兒中就有一名患有OTC的缺失。James Wilson團(tuán)隊(duì)用AAV8血清型載體將作為剪切工具的核酸酶Cas9特異性導(dǎo)入肝細(xì)胞中。另一個(gè)載體將gRNA帶到特異性DNA靶位點(diǎn)，從而達(dá)到定點(diǎn)突變。

AAV作為基因治療非常重要的載體之一，是目前唯1個(gè)NIH評(píng)級(jí)為RG1的病毒載體，迄今從未發(fā)現(xiàn)野生型AAV致?。恢亟MAAV去除了野生型AAV基因組的96%，進(jìn)一步保證了安全性；由于AAV不插入基因組，因而沒有致癌性；其本身的免疫原性又基本不會(huì)引起免疫排斥，相對(duì)其他病毒優(yōu)勢非常明顯。但同時(shí)，由于AAV的包裝容量過小，對(duì)基因大小限制較多，其應(yīng)用場景有限。而且，使用AAV作為載體的基因治療需要消耗大量的病毒，并可能需要多次注射，如何降低生產(chǎn)成本也成為目前各方關(guān)注的焦點(diǎn)。

除了以上兩種主流病毒之外，在基因治療領(lǐng)域，腺病毒、溶瘤病毒也都有其一席之地，因篇幅所限，在這里我們不展開討論。