與DNA凝膠電泳一樣，蛋白質(zhì)凝膠電泳也是實(shí)驗(yàn)室中稀松平常的工作。無(wú)論是Western blot還是質(zhì)譜分析，都離不開(kāi)蛋白電泳。研究人員通過(guò)大小（1D）和電荷（2D）來(lái)分辨蛋白質(zhì)。當(dāng)然，僅僅分離蛋白是不夠的，它們必須要經(jīng)過(guò)染色。染料的選擇有很多，具體選哪種，這取決于靈敏度要求、現(xiàn)有的設(shè)備和下游的應(yīng)用。

常規(guī)之選

研究人員主要使用三種染料來(lái)處理日常的蛋白凝膠：考馬斯藍(lán)、銀染和熒光。據(jù)Sigma-Aldrich公司蛋白技術(shù)的研發(fā)經(jīng)理Jeffrey Turner介紹，染料的選擇基本上可以歸結(jié)為“靈敏度 vs. 速度”。

考馬斯藍(lán)也許是zui常用的染料。作為一種可見(jiàn)的顯色（亮藍(lán)色）染料，它不需要任何特殊的設(shè)備。不過(guò)，Bio-Rad的業(yè)務(wù)開(kāi)發(fā)經(jīng)理Ning Liu認(rèn)為，它的靈敏度也zui低，檢測(cè)極限大約在10-100 ng蛋白質(zhì)。

很多公司提供不同配方的考馬斯藍(lán)染料，它們?cè)谑褂煤?jiǎn)便程度、整體染色時(shí)間和脫色要求上各有不同。例如，有些需要在乙醇/乙酸中固定，而有些只使用純水。Expedeon的InstantBlue?試劑可在電泳后直接添加到凝膠中，而不需要固定或脫色，染色可在15分鐘內(nèi)完成。Bio-Rad的QC Colloidal Coomassie Stain操作則建議慢慢來(lái)，以便達(dá)到更好的效果。整個(gè)過(guò)程包括在40%乙醇/10%乙酸中固定15分鐘，之后染色1-20個(gè)小時(shí)，再脫色1-3小時(shí)。

有了古朵生物推出的Pierce? Power Stainer，研究人員可以讓考馬斯藍(lán)染色自動(dòng)化。據(jù)它的產(chǎn)品經(jīng)理Emily Goplen介紹，這臺(tái)設(shè)備可對(duì)兩塊凝膠進(jìn)行染色和脫色。“盡管傳統(tǒng)的染色需要幾小時(shí)甚至過(guò)夜，Power Stainer卻能在10分鐘內(nèi)完成染色和脫色的過(guò)程，并且預(yù)制膠和自制膠都適用，”她說(shuō)。

另一種常用方法是銀染，每條帶的靈敏度大約在0.1-0.25 ng。操作過(guò)程沒(méi)有脫色步驟，但是一個(gè)很長(zhǎng)的過(guò)程，大約在2小時(shí)左右，而且相當(dāng)講究。此外，據(jù)Turner介紹，操作需要用到一些有害的化學(xué)物質(zhì)，如甲醛和銀，在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。因此，人們一般不大愿意用這種方法，除非靈敏度很重要。

熒光染料的靈敏度則居中，可檢測(cè)幾納克的蛋白質(zhì)，不過(guò)你得有一個(gè)兼容的凝膠成像系統(tǒng)或透射儀。與考馬斯藍(lán)和銀染一樣，熒光染色通常在電泳后進(jìn)行，需要固定和脫色，不過(guò)也有例外。例如，SYPRO Ruby需要脫色，但Oriole和Flamingo不需要，因?yàn)橛坞x的染料不發(fā)熒光。“染料本身不會(huì)被激光激發(fā)，只有當(dāng)它與蛋白結(jié)合時(shí)才被激發(fā)，”Liu解釋道。

除了這些常規(guī)的染料，你還有一些特殊的選擇。例如，古朵生物為糖基化和磷酸化的蛋白提供了Pro-Q熒光染料，同時(shí)也提供InVision? His-tag In-gel Stain和Lumio? Green Detection Kit來(lái)檢測(cè)帶標(biāo)簽的蛋白。

升級(jí)之選

有些染料則讓你省去了電泳后的洗滌和染色。比如，Bio-Rad的Stain-Free?預(yù)制膠預(yù)加了一種與色氨酸結(jié)合的“三鹵”熒光染料。電泳后，凝膠暴露在紫外線(xiàn)下會(huì)激活染料，使其與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合。據(jù)介紹，這種染料的靈敏度與考馬斯藍(lán)差不多。

另一個(gè)選擇是GE Healthcare的Amersham? WB系統(tǒng)。有了這個(gè)系統(tǒng)，樣品在電泳之前與Cy 5熒光基團(tuán)偶聯(lián)。據(jù)GE Healthcare的*科學(xué)家?sa Hagner McWhirter介紹，在電泳過(guò)程中，游離的染料會(huì)跑出凝膠，因此沒(méi)必要脫色，而且靈敏度在50-100 pg的范圍。更方便的是，這個(gè)系統(tǒng)在電泳結(jié)束后自動(dòng)對(duì)凝膠成像并分析結(jié)果。

Liu和McWhirter都指出，電泳前染色的方法有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，就是染料與分離后的蛋白共價(jià)結(jié)合。因此，在后續(xù)的步驟中能夠觀(guān)察這些蛋白，特別是在Western blot中，可利用總蛋白的信號(hào)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)蛋白的信號(hào)，而不像平常那樣用看家蛋白。

“這種方法明顯消除了人們對(duì)看家蛋白對(duì)照的兩個(gè)擔(dān)心，”Liu表示。，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，看家蛋白的水平有時(shí)候會(huì)變化。其次，它們的水平可能超出了檢測(cè)的線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍，使得定量變得復(fù)雜?！禩he Journal of Biological Chemistry》雜志也建議使用總蛋白水平來(lái)進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)化。

McWhirter認(rèn)為，預(yù)標(biāo)記也明顯提高了凝膠之間的重復(fù)性，因?yàn)橄礈旌腿旧牟襟E難以控制。“不同反應(yīng)間的CV要比在不同溶液中孵育凝膠要低得多，”她指出。事實(shí)上，她聲稱(chēng)在內(nèi)部分析14個(gè)樣品時(shí)，Cy5信號(hào)的CV大約在5%。“這基本上和移液誤差差不多。”

關(guān)鍵考慮

無(wú)論你選擇哪種染料，在考慮靈敏度、速度和硬件要求外，你還要考慮下游怎么處理凝膠。若是印跡雜交，研究人員通常不用考馬斯藍(lán)染色，因?yàn)槿玖闲枰潭ǖ牟襟E，會(huì)將蛋白困在凝膠里。他們要么平行跑一塊相同的膠，要么在轉(zhuǎn)印之后對(duì)印跡膜染色。同樣，與蛋白共價(jià)結(jié)合的染料有可能干擾抗體結(jié)合或質(zhì)譜分析。

當(dāng)然，并沒(méi)有一個(gè)放之四海而皆準(zhǔn)的解決方案?？捡R斯藍(lán)是大多數(shù)研究人員的染色，但在特殊情況出現(xiàn)時(shí)，我們還是有很多其他的選擇。