2013年，哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員曾在《Nature Review Genetics》雜志上發(fā)表了一篇很有意思的綜述，討論了新一代測(cè)序（NGS）實(shí)驗(yàn)中錯(cuò)誤的來(lái)源¹。文章指出，在樣品制備和文庫(kù)制備環(huán)節(jié)，用戶操作失誤（user error）都是常有的事，比如貼錯(cuò)標(biāo)簽或者加錯(cuò)溶液。

然而，測(cè)序畢竟不同于核酸純化，后者失敗了大不了重做。對(duì)測(cè)序而言，一個(gè)簡(jiǎn)單的移液或混合錯(cuò)誤有可能讓你付出高昂的代價(jià)。無(wú)論老板是否nice，測(cè)序?qū)嶒?yàn)從頭再來(lái)的感受肯定不佳，實(shí)驗(yàn)室需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和成本，況且有些樣本還很稀有。不過(guò)，每次要處理那么多的樣本，即使打起十二分精神，還是難保不出錯(cuò)。

為了避免操作失誤的發(fā)生，賽默飛想到了一個(gè)絕妙的好辦法。Invitrogen Collibri系列文庫(kù)制備試劑盒中的每種試劑都帶有一種示蹤染料，便于人們清晰觀察文庫(kù)制備過(guò)程。若你看到溶液均勻變色（比如從藍(lán)色變?yōu)榫G色，圖1），則可以確信相關(guān)試劑已添加且*混勻。若是漏加了某種試劑，或者沒(méi)有混合均勻，則觀察不到預(yù)期的顏色變化。

圖1. Collibri PS DNA文庫(kù)制備試劑盒的顏色變化

不用擔(dān)心，試劑中的惰性染料既不會(huì)干擾酶促反應(yīng)，也不會(huì)影響測(cè)序結(jié)果。后純化所得的文庫(kù)是澄清透明的。這種實(shí)時(shí)的顏色變化提示，讓操作失誤的可能性大大降低，也讓你對(duì)文庫(kù)制備的過(guò)程充滿信心。

看到這里，你一定想知道，Collibri系列文庫(kù)制備試劑盒包含哪些產(chǎn)品，適合哪些應(yīng)用？其實(shí)，針對(duì)全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，此系列都有相應(yīng)的試劑盒提供，均適用于Illumina的高通量測(cè)序儀。下面就讓小編來(lái)一一介紹。

全基因組測(cè)序

? Collibri PS DNA文庫(kù)制備試劑盒適用于物理片段化的基因組，支持1-1,000 ng的樣本起始量
? Collibri PCR-Free PS DNA文庫(kù)制備試劑盒同樣適用于物理片段化的基因組，采用PCR-free的實(shí)驗(yàn)方案，支持500-1,000 ng的樣本起始量
? Collibri ES DNA文庫(kù)制備試劑盒適用于酶法片段化的基因組，支持1-500 ng的樣本起始量
? Collibri PCR-Free ES DNA文庫(kù)制備試劑盒同樣支持酶法片段化的基因組，采用PCR-free的實(shí)驗(yàn)方案，支持100-500 ng的樣本起始量

根據(jù)片段化方式的不同，Collibri DNA文庫(kù)制備試劑盒可分為兩大類：物理片段化（PS）和酶法片段化（ES）。物理方法片段化主要是利用機(jī)械破碎的方法將基因組隨機(jī)打斷，如超聲破碎、霧化等。酶學(xué)方法片段化主要利用酶的剪切功能將基因組片段化。酶法片段化方式操作簡(jiǎn)單，但物理片段化方式的片段隨機(jī)性更好。此外，每種試劑盒都有PCR擴(kuò)增產(chǎn)品和PCR-free產(chǎn)品可選。

與同類產(chǎn)品相比，Collibri系列文庫(kù)制備試劑盒能夠在更短時(shí)間內(nèi)完成建庫(kù)。以Collibri PCR-Free PS DNA文庫(kù)制備試劑盒為例，文庫(kù)制備可在1.5小時(shí)內(nèi)完成，而整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程的總時(shí)間縮短至6.5小時(shí)。其他產(chǎn)品一般需要7小時(shí)以上，甚至超過(guò)10小時(shí)。

若起始材料有限，可以選擇PCR方案。不管是PCR-free文庫(kù)還是經(jīng)PCR擴(kuò)增的文庫(kù)，都可以始終保持均一的GC覆蓋度，將GC bias降至低。即使是“測(cè)序困難戶”，如bad promoters或GC含量高達(dá)75%的區(qū)域，覆蓋度也優(yōu)于同類產(chǎn)品，包括FFPE樣本。這種高覆蓋度使得突變檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度得到增強(qiáng)。

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Collibri DNA文庫(kù)制備試劑盒能夠地檢測(cè)新生突變（De Novo mutations）。不管是PCR方案還是PCR-free方案，它們都能夠檢測(cè)SNP，對(duì)于10 ng及以上的起始DNA樣本量，Collibri PS DNA文庫(kù)制備試劑盒的SNP recall高于98.8%（圖2）。此外，即使是低起始量樣本，插入突變檢測(cè)的indel recall也高于同類產(chǎn)品。

Collibri DNA文庫(kù)制備試劑盒包含了WGS文庫(kù)構(gòu)建所需的所有組分，除了核心酶組分以外，還包括磁珠及經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的indexed adaptors，無(wú)需再單獨(dú)購(gòu)買。試劑盒隨附提供*雙端index（UDI）。與傳統(tǒng)的CDI相比，UDI的使用大大降低了標(biāo)簽串?dāng)_（index hopping）的比例。

圖2. 檢測(cè)突變

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

Collibri RNA測(cè)序建庫(kù)流程不同于市面上一般的RNA-Seq建庫(kù)流程。RNA經(jīng)酶片段化后直接與adaptor（含有輔助oligo）連接，之后逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，后再通過(guò)PCR擴(kuò)增引入index（圖3）。

這種*的建庫(kù)流程可保留樣本的復(fù)雜度，適用于不同質(zhì)量的樣本類型，如完整RNA、降解RNA、FFPE樣本等。使用統(tǒng)一引物進(jìn)行cDNA合成，不會(huì)受GC含量的影響，且無(wú)需引入隨機(jī)Oligo序列，避免檢測(cè)SNP或點(diǎn)突變時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性。

圖3. Collibri RNA測(cè)序建庫(kù)流程

Collibr™ Stranded RNA文庫(kù)制備試劑盒同樣能夠?qū)崿F(xiàn)快速建庫(kù)。包括rRNA去除在內(nèi)，轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建可在6.5小時(shí)內(nèi)完成。這樣使得從RNA提取到文庫(kù)構(gòu)建完成的總時(shí)間縮短至10.5小時(shí)左右。

可選的Collibri H/M/R rRNA Depletion Kit還能從100-1000 ng人、小鼠或大鼠總RNA中去除rRNA。與市面上其它rRNA去除方法不同，這種試劑盒基于親和探針雜交和磁珠純化方法，可特異地去除rRNA序列。探針的數(shù)量和靶向位置均經(jīng)精心設(shè)計(jì)，可以去除28S、18S、5.8S、45S、5S、mt16S和mt12S核糖體序列。

Collibri RNA文庫(kù)制備試劑盒內(nèi)包含RNA-Seq文庫(kù)構(gòu)建所需的所有組分，除了片段化酶、RNA末端修飾試劑、Adaptor、連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑、文庫(kù)擴(kuò)增試劑外，還包含rRNA去除試劑、純化磁珠以及index primer等。

文庫(kù)定量

基于qPCR的Collibri文庫(kù)定量試劑盒能夠?qū)ξ膸?kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，適合大批量樣本的文庫(kù)定量。該試劑盒包含Collibri文庫(kù)定量預(yù)混液、Collibri DNA標(biāo)準(zhǔn)品和Collibri文庫(kù)稀釋緩沖液。在文庫(kù)定量時(shí)，使用一組6個(gè)預(yù)先稀釋的DNA參考標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)這一標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)定樣本文庫(kù)濃度。

基于Invitrogen™ Platinum™ II Taq 熱啟動(dòng)DNA聚合酶的qPCR預(yù)混液含有靶向Illumina P5和P7 Adaptor序列的引物。Platinum II Taq 熱啟動(dòng)DNA聚合酶可以均勻擴(kuò)增GC含量不同和長(zhǎng)短各異的DNA片段，因此是定量測(cè)序文庫(kù)的理想選擇。

與熒光檢測(cè)方法相比，qPCR檢測(cè)近測(cè)定含有P5和P7 Adaptor的文庫(kù)片段，因此能夠更加特異和準(zhǔn)確地檢測(cè)NGS測(cè)序文庫(kù)。Collibri檢測(cè)十分靈敏，可以定量飛摩爾量級(jí)的片段文庫(kù)。起始量要求極低，通常僅需4 μL稀釋的文庫(kù)樣本，濃度>0.0002 pM即可。同樣，顏色指示可降低反應(yīng)配制期間移液錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。