驗(yàn)證抗體對于結(jié)果的一致性和重復(fù)性是至關(guān)重要的，即確認(rèn)抗體能特異性識別感興趣的蛋白，抗體與其他蛋白的交叉反應(yīng)性Qing況。在您的論文提交給期刊發(fā)表之前，經(jīng)常需要驗(yàn)證抗體的特異性，但并非所有人都花時(shí)間進(jìn)行驗(yàn)證?；蛘吆芏嗳硕颊J(rèn)為他們使用抗體進(jìn)行了免疫共沉淀驗(yàn)證，因而不需要再通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行驗(yàn)證。然而，抗體與抗原的親和性高度依賴于實(shí)驗(yàn)條件，因此，驗(yàn)證您的試驗(yàn)方法中的條件適用于抗體與抗原的結(jié)合是十分重要的。

定量western blot尤其適用于確認(rèn)獲得的信號僅來自感興趣的蛋白。如果沒有進(jìn)行抗體驗(yàn)證（并且驗(yàn)證熒光信號與蛋白質(zhì)的量呈線性關(guān)系），將無法獲得下游定量分析所需的準(zhǔn)確度和度。

為確保實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，抗體驗(yàn)證工作組提供了五種不同的抗體驗(yàn)證方法，其中四種方法適用于western blot，他們建議至少使用其中兩種方法進(jìn)行抗體驗(yàn)證。
 

遺傳策略

盡管這些方法已經(jīng)被更新了，但在科研領(lǐng)域中的生物化學(xué)家對他們應(yīng)該都很熟悉。即用CRISPR-Cas9或RNA干擾（RNAi）在實(shí)驗(yàn)組和對照組中進(jìn)行敲除或敲低實(shí)驗(yàn)，然后使用特異性抗體測定目標(biāo)蛋白的熒光信號。處理后的目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)很少甚至沒有，所以觀察到的任何信號都表明抗體存在交叉反應(yīng)性。

如下圖所示，將具有特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物進(jìn)行western blot，分別使用兩種不同siRNA分子敲低目的蛋白的表達(dá)，如泳道1和泳道2，與泳道C的對照組相比，我們可以看出siRNA脫靶帶來的影響。

正交策略

這種方法的技術(shù)含量較低，它使用不依賴于抗體的方法（質(zhì)譜法）來量化幾個(gè)蛋白樣品的靶信號，然后使用基于抗體的方法（western blot）同樣量化相同蛋白樣品的靶信號，后將他們的信號值進(jìn)行比較。例如，有幾種靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以量化不同樣品中的蛋白質(zhì)表達(dá)。當(dāng)對抗體進(jìn)行標(biāo)記時(shí)應(yīng)參考這些相關(guān)的定量數(shù)據(jù)。

下圖比較了蛋白質(zhì)印跡和質(zhì)譜法測定蛋白表達(dá)量的相關(guān)性。通過對八種細(xì)胞系中蛋白表達(dá)量的測定，我們可以看到他們的相關(guān)性高達(dá)0.97，表明該抗體對于蛋白質(zhì)印跡分析是有效的。

獨(dú)立抗體策略

使用針對相同靶標(biāo)的兩種或更多種不同抗體是測量抗體特異性的直觀且有效的方法。在相同的實(shí)驗(yàn)條件中測定抗體相關(guān)性十分重要。如果抗體具有不同的抗體表位（即抗體結(jié)合抗原的不同區(qū)域）則表明該抗體是獨(dú)立的。這樣，它們不可能表現(xiàn)出脫靶效應(yīng)并結(jié)合與該研究無關(guān)的同一蛋白質(zhì)，這種方法可結(jié)合敲除或敲低的方法一起使用。

如下圖，對目的蛋白使用了兩種獨(dú)立的抗體，并且我們可以確定來自八種細(xì)胞系中的每一種信號的相關(guān)性。注意要檢查整塊凝膠，因?yàn)槊摪行?yīng)帶來的結(jié)果是非特異條帶可能在整塊膠的任意位置。

表達(dá)帶有標(biāo)簽的蛋白

還可以通過表達(dá)具有親和標(biāo)簽（例如FLAG或v5）或熒光蛋白（例如GFP或YFP）的蛋白質(zhì)來驗(yàn)證抗體。然后可以使抗體表達(dá)與另一種方法的表達(dá)相匹配，但是這種方法局限性在于標(biāo)記內(nèi)源基因。值得注意的是過表達(dá)目標(biāo)蛋白可能會(huì)人為地淹沒脫靶結(jié)合，然后無法驗(yàn)證抗體。

驗(yàn)證抗體對于western blot實(shí)驗(yàn)十分重要，并且western反過來可以用來驗(yàn)證ELISA或者IHC。

Azure有兩種產(chǎn)品可幫助確認(rèn)您的抗體是否具有特異性和選擇性結(jié)合：

（1）HRP偶聯(lián)的二抗：可用來檢測化學(xué)發(fā)光WB中的低豐度蛋白質(zhì)；
（2）熒光二抗：在熒光Western blot中發(fā)射可見光和近紅外波長的光。