微生物組研究通常歸結(jié)于兩類問題：誰在那兒以及它們?cè)诟墒裁?。為了回答這些問題，生物學(xué)家往往使用新一代測(cè)序。16S rRNA測(cè)序能夠揭示微生物的身份，而轉(zhuǎn)錄本測(cè)序又能夠提供線索，說明這些微生物在干什么。

不過，除了測(cè)序，研究人員也利用改造的遺傳工具來研究微生物組。下面，我們就來看看他們?nèi)绾卫觅|(zhì)粒工具來開展微生物組研究。

盡管人們能夠通過測(cè)序來監(jiān)控微生物組，但遺傳改造其成員的能力還十分有限，而且許多微生物難以在其天然環(huán)境以外的地方培養(yǎng)。因此，哥倫比亞大學(xué)的Harris Wang實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種原位改造腸道微生物組成員的方法，并發(fā)表在《Nature Methods》雜志上1。

他們將這種方法稱為MAGIC（通過原位接合來改造腸道微生物組）。在MAGIC方法中，研究人員將大腸桿菌供體菌株引入微生物組，從而利用IncPα-family-RP4接合系統(tǒng)將遺傳負(fù)荷導(dǎo)入受體。此系統(tǒng)可將質(zhì)粒引入革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。

研究人員進(jìn)一步開發(fā)出一套pGT質(zhì)粒，帶有各種復(fù)制起點(diǎn)，適用于各種微生物。它們還含有RP4轉(zhuǎn)移起點(diǎn)、可選擇的標(biāo)記以及所需的遺傳負(fù)荷（如GFP）。因此，細(xì)胞可利用FACS進(jìn)行分選，并通過抗生素選擇進(jìn)行分離。

他們?cè)隗w外和體內(nèi)測(cè)試了該系統(tǒng)。他們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)19個(gè)屬的細(xì)胞通過接合系統(tǒng)攝取了質(zhì)粒，不過在體外實(shí)驗(yàn)中只鑒定出7個(gè)屬，這可能是因?yàn)轶w外條件不能很好地支持有些物種的生長(zhǎng)。這些結(jié)果也突出了微生物組研究需要原位改造工具。

分析腸道菌群的紙片法

對(duì)于臨床和診斷實(shí)驗(yàn)室而言，在處理大量微生物組樣本時(shí)，深度測(cè)序和qPCR方法都過于昂貴和耗時(shí)。為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的腸道微生物組研究，麻省理工學(xué)院的James Collins實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出一種“紙片法”，可檢測(cè)紙上的微生物和生物標(biāo)志物。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上2。

這種方法的核心在于一種RNA Toehold開關(guān)，這是一種RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可結(jié)合和檢測(cè)幾乎任何RNA序列。發(fā)夾的下游是核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS），接著是報(bào)告基因。發(fā)夾通過隔離RBS而阻斷翻譯，但“trigger RNA”的結(jié)合能夠暴露出RBS，讓報(bào)告基因得以翻譯，從而產(chǎn)生GFP信號(hào)。通過標(biāo)準(zhǔn)品的使用，這種方法可估算出樣品中mRNA的濃度。

Collins實(shí)驗(yàn)室選擇了10種與疾病相關(guān)的細(xì)菌，并設(shè)計(jì)出Toehold開關(guān)傳感器（TSS），可對(duì)菌種特異的mRNA進(jìn)行半定量檢測(cè)。另外，他們還針對(duì)鈣網(wǎng)蛋白和抑癌蛋白M等四種生物標(biāo)志物開發(fā)出TSS，以分析炎癥性腸病患者的糞便樣本，并用RT-qPCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。

研究人員還證明，利用此平臺(tái)可以檢測(cè)艱難梭菌（Clostridium difficile）毒素mRNA的表達(dá)。由于mRNA表達(dá)無法通過qPCR方法來鑒定，故他們認(rèn)為這種檢測(cè)毒素mRNA轉(zhuǎn)錄本及其他轉(zhuǎn)錄本的能力具有潛在價(jià)值。

研究蜂類的微生物組

對(duì)動(dòng)物微生物組中存在的細(xì)菌進(jìn)行改造，有望在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)方面取得突破，不過對(duì)于蜂類微生物組，目前就缺乏這樣的工具。德克薩斯大學(xué)*分校的Nancy Moran和Jeffrey Barrick實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出Bee Microbiome Toolkit（BTK）來研究大黃蜂和蜜蜂的微生物組3。

這個(gè)工具箱含有模塊化的組件，可通過Golden Gate組裝技術(shù)組裝在一起，從而快速檢驗(yàn)新分離細(xì)菌的多種抗生素抗性標(biāo)記、啟動(dòng)子、熒光報(bào)告蛋白及其他編碼序列。

研究人員利用BTK來操控蜜蜂和大黃蜂腸道內(nèi)固有的變形菌，在一系列變形菌中表達(dá)熒光蛋白，讓人們能夠觀察到這些細(xì)菌如何在蜂類的腸道里定植。此外，他們還能夠利用BTK來導(dǎo)入CRISPR組分，實(shí)現(xiàn)基因功能的破壞或干擾。盡管這些質(zhì)粒是為蜂類設(shè)計(jì)的，但它們適合廣泛的宿主，也可用來研究其他動(dòng)物的微生物組。

對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)行計(jì)數(shù)

監(jiān)控腸道內(nèi)微生物群體的動(dòng)態(tài)，有助于研究人員了解微生物組如何應(yīng)對(duì)感染、失調(diào)和抗生素治療。為了促進(jìn)這方面的研究，哈佛醫(yī)學(xué)院的Pamela Silver實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出一種合成標(biāo)記和重新捕獲策略，對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)行計(jì)數(shù)。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上4。

這種技術(shù)稱為分布式細(xì)胞分裂計(jì)數(shù)（DCDC），它是將熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)組裝成明亮的顆粒。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室將紅色熒光蛋白（RFP）與自組裝蛋白（SAP）相融合，比如噬菌體衣殼蛋白。這種融合蛋白的表達(dá)受到阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制。

在實(shí)驗(yàn)過程中，首先用阿拉伯糖誘導(dǎo)細(xì)胞，讓SAP-RFP融合體開始表達(dá)。然后，洗滌細(xì)胞，不再產(chǎn)生新的顆粒。在后續(xù)細(xì)胞分裂的過程中，含有顆粒的細(xì)胞隨時(shí)間的變化呈指數(shù)下降，以此確定細(xì)胞分裂的次數(shù)。這種方法可用于體內(nèi)和體外研究。