λgtll 重組噬菌體 大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株

細(xì)胞裂解液 IPTG MgS04•7 H20 苯j(luò)ia基磺酰氯 SM LB 培養(yǎng)液

SorvallSS-34 轉(zhuǎn)子或同等產(chǎn)品 沸水水浴 液氮

材料

緩沖液劑及溶液

貯存液，緩沖液及試劑的組分見附錄 1。
將貯存液稀釋至合適濃度。

細(xì)胞裂解液（每個(gè)分析的噬斑需 100ul)

50 mmol/L Tris-Cl (pH6.8)
100 mmol/L 二硫蘇糖酵
2%(m/V)SDS
0.1%(m/V) 溴酚藍(lán)
10%(V/V) 甘油

IPTG(1mol/L)(每個(gè)分析的噬斑需 70ul)

MgS0₄•7 H₂0(1mol/L)

苯j(luò)ia基磺酰氯（PMSF)(100 mmol/L)

SM
用完后棄掉以防污染。

凝膠

SDS-聚丙烯酰胺凝膠

培養(yǎng)液

含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液

離心機(jī)及轉(zhuǎn)子

SorvallSS-34 轉(zhuǎn)子或同等產(chǎn)品

設(shè)備

沸水水浴

液氮

載體及細(xì)菌菌株

λgtll 重組噬菌體
制備λ重組噬菌體貯存液：?jiǎn)蝹€(gè)噬斑放入約 1mlSM 中室溫放置 2 h 成通過制備平板裂解液來制備（見第 2 章方案 3)。

大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株
此菌株可通過 ATCC 獲得，關(guān)于大腸桿菌 Y1090 菌株有關(guān)信息，見本章信息欄中質(zhì)粒及λ噬菌體表達(dá)載體相關(guān)內(nèi)容。

方法

1. 取大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株單個(gè)菌落接種到 50 ml 含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液中，37°C 過夜培養(yǎng)，并不斷溫和振蕩（搖床 250r/min)。

2. 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫下 4000 g(SarvallSS-34 型轉(zhuǎn)子 58OOr/min) 離心10min。

3. 棄上清，用 25 ml10mmol/LMgS0₄ 重懸細(xì)胞，使用前將細(xì)菌懸液置于冰上保存。

4. 在 15 ml 無(wú)菌管中，將 8 ml 含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB，400ul 細(xì)菌懸液及 100ul 噬菌體裂解液混合。
因?yàn)槿诤系鞍踪|(zhì)是從感染細(xì)胞本身分離的而非裂解液, 因此有必要獲得目的λ噬菌體的高產(chǎn)量感染同時(shí)避免培養(yǎng)物的過早溶菌現(xiàn)象。由此. 在操作過程中，常使用低感染復(fù)數(shù)（毎 16000 細(xì)胞約 1 pfu)。

5. 將管放于 37°C 水浴中振蕩 2 h。

6. 每份培養(yǎng)物取 lml 到無(wú)菌微量離心管中，蓋緊管蓋，存于液氮中。向剩余感染的培養(yǎng)物中加 70ul 1mol/LIPTG,37°C 繼續(xù)培養(yǎng)。

7. 每隔 1 h, 每份感染的細(xì)胞培養(yǎng)物取 1 ml 轉(zhuǎn)到微離心管中，蓋緊管蓋，存于液氮中。通過此方式，收集 4 h 內(nèi)的小份培養(yǎng)液。

8. 剩余的感染培養(yǎng)物 37°C 繼續(xù)溫育 12 h, 從每份培養(yǎng)物中后一次取 lml 樣品，蓋緊管蓋，液氮中放 30 min。

9. 融化所有樣品，于室溫大速度離心 1 min, 收集感染的細(xì)菌，去掉細(xì)菌培養(yǎng)液。

10. 每管中加 100ul 裂解緩沖液，強(qiáng)烈渦旋迅速重懸細(xì)胞。

11. 將樣品放入沸水中 3 min, 轉(zhuǎn)到室溫加 1ul 100 mmol/LPMSF, 振蕩混勻。

12. 用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳與免疫印跡直接分析樣品。電泳前，樣品在微離心機(jī)中大轉(zhuǎn)速 1 min, 取 25 上清液加到 SDS-聚丙烯凝膠上或放到-70°C 保存直至使用。
用 IPTG 處理培養(yǎng)物后目的融合蛋白的量在 1~4 h 內(nèi)是逐步增高的。此后，蛋白質(zhì)的量雖可能增加，可能保持不變，也可能因感染的細(xì)胞裂解釋放蛋白質(zhì)到培養(yǎng)物中而降低。