據(jù)估計，因抗體質量不佳， 生命科學領域每年的損失達到 8 億美元。這也造成了無數(shù)的實驗失敗，浪費了寶貴的資源和科學家的時間。盡管科學界已經(jīng)意識到這個問題，但目前仍然缺乏抗體驗證的整體框架。
為了刺激研究界實現(xiàn)更高標準的抗體重復性，抗體驗證工作組(IWGAV)于 2016 年 9 月份出臺了一套抗體驗證指南并發(fā)表在《Nature Methods》雜志上， 題為「A Proposal for Validation of Antibodies」， 強調了抗體驗證需要針對應用和背景來開展。文章提出了五點，以指導特定應用中的抗體驗證。
遺傳策略：測定對照細胞或組織中的相關信號，這些對照中的目標基因已利用 CRISPR 或 RNAi 等技術敲除或敲低。
正交策略：利用不依賴抗體的方法定量多個樣品，然后檢查依賴抗體和不依賴抗體這兩種定量之間的相關性。
獨立抗體策略：找到多個抗體來識別目標蛋白上面的不同表位，一般來說，蛋白質的 C 端具有較好的親水性、表面可及性和柔性，所以是很好的抗原決定簇區(qū)域。在人蛋白質中，約 81% 的蛋白質其 C 末端的 5 個氨基酸殘基的小肽是該蛋白質所*的，制備針對蛋白質 C 末端小肽的抗體，常常能得到特異性識別該全蛋白的抗體。另外，蛋白的二級結構是 B 細胞表位計算機預測的重要參數(shù)之一，β轉角為凸出結構，多出現(xiàn)在蛋白質抗原表面，有利于與抗體結合，較可能成為抗原表位。而α螺旋和β折疊結構規(guī)則不易變形，較難結合抗體，一般不作為抗原表位。含有 5 個以上的氨基酸殘基的轉角又常稱為環(huán) (loop)。以往的研究表明，蛋白表面的 loop 區(qū)可能為功能性抗體的識別位點，特異性好，可及性強。利用這類似抗原性分析結果，找到兩個或者多個獨立抗體，再通過比較和分析定量來確認特異性。
表達標記蛋白：修飾內源的目標基因，增加親和標簽或熒光蛋白的序列。標記蛋白的信號可與基于抗體的檢測相關聯(lián)。該方法有其局限性，當目標蛋白較小，或者結構較敏感的時候，融合親和標簽或者熒光蛋白有可能在結構上影響目標蛋白，從而改變其免疫原性。
免疫捕獲加上質譜分析：將免疫捕獲與 MS 分析相結合，以確定與純化的抗體直接作用的蛋白質，以及可能與目標蛋白形成復合物的蛋白質。該方案能夠確定與純化的抗體直接作用的蛋白質，以及可能與目標蛋白形成復合物的蛋白質，但是需要依賴昂貴的儀器和實驗材料，對于一般實驗室而言，難以普及。
通過比較上述五種方案，遺傳方案利用 CRISPR 或者 RNAi 技術敲除或者降低目的蛋白表達，是比較直接有效的方法，將敲除后細胞系作為負對照與野生型平行比較，如果抗體是真的特異的，在敲除細胞系中就不會檢測到目的蛋白的信號，但在野生型中就會檢測到特定的信號。因此，敲除驗證的方法可以提供一個陰性對照用于驗證抗體對目的蛋白的特異性。
該方法雖然直接，但是如果很難得到該基因敲除后細胞系，該實驗方法的可行性將大幅度降低。不過隨著生命科學領域市場的不斷完善，商業(yè)化的 Knockout Cell(KO 細胞)裂解液已經(jīng)比較成熟。市面上銷售的多種細胞系 Knockout Cell(KO 細胞)裂解液已經(jīng)有上千種。如果您研究的目的基因正好有商業(yè)化 Knockout Cell(KO 細胞)裂解液，將節(jié)省您和大量的資源和寶貴的時間。
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