不論是對活體還是體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞，慢病毒表達(dá)載體對遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率至關(guān)重要。慢病毒早起源于人免疫缺陷病毒 (HIV) 或貓免疫缺陷病毒(FIV)，能夠感染幾乎所有類型的細(xì)胞，包括難以用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染甚至無法用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
許多客戶對如何用慢病毒顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)持有疑問，特別是對如何選擇適合的慢病毒量感到困惑。這個(gè)問題可根據(jù)確定細(xì)胞的*感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection, MOI)來解決。
什么是 MOI？
選購慢病毒顆粒之前，首先需了解目的細(xì)胞的*感染復(fù)數(shù)：MOI。MOI 的概念很簡單，可有效感染細(xì)胞的慢病毒顆粒數(shù)與被感染細(xì)胞數(shù)的比值即為該細(xì)胞的 MOI 值。
例如，應(yīng)用 106 TU 慢病毒感染 106 個(gè)細(xì)胞可成功使 80% 以上細(xì)胞達(dá)到轉(zhuǎn)導(dǎo)目的時(shí)，MOI=1；如需要以 5 × 106 TU 病毒才可成功感染 106 個(gè)細(xì)胞，則 MOI = 5。(TU/mL 為慢病毒滴度單位，TU 表示有活性的慢病毒量)
如何確定目的細(xì)胞的 MOI 值？
慢病毒對不同類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率各不相同，因此 MOI 也各異。在此，我們列出了多種常用細(xì)胞系的 MOI，助您選購合適的慢病毒量。下表是 GeneCopoeia 通過實(shí)驗(yàn)摸索得出的多種細(xì)胞系的 MOI 參考值。
了解慢病毒滴度是獲得* MOI 的前提條件。根據(jù)上表，若您的實(shí)驗(yàn)對象是ru腺癌細(xì)胞系 MCF-7，其* MOI 參考值= 2，那么當(dāng)您購買了 50μL 的慢病毒顆粒(滴度是 108 TU/mL)時(shí)，您得到的慢病毒總量為 5×106TU。在 MOI= 2 的條件下，您所購買的慢病毒足夠轉(zhuǎn)導(dǎo) MCF-7 在 24 孔板中鋪板培養(yǎng)的其中 5 孔(約合 4×105 細(xì)胞/孔)。若您的目的細(xì)胞系 MOI 要求較高，您需要購買或自行包裝更多慢病毒顆粒。
請注意：
上表所示的 MOI 值僅供您選購慢病毒時(shí)作為用量參考。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)、操作手法等的差別，實(shí)際數(shù)據(jù)可能有輕微浮動。所以當(dāng)您收到所購買的慢病毒時(shí)，我們?nèi)匀唤ㄗh您通過設(shè)計(jì)梯度 MOI 感染小量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(如：MOI = 0.3, 1, 3, 5, 10, etc.)檢測目的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，確認(rèn)其 MOI 值。另外，若您的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞未被列在上表中，梯度實(shí)驗(yàn)確定* MOI 是至關(guān)重要，甚至*的。您可將病毒進(jìn)行梯度稀釋，分別感染等量的細(xì)胞(見圖 1)。
進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的 1 天前，于 96 孔板鋪板培養(yǎng)目的細(xì)胞 (實(shí)例中使用了 H1299 細(xì)胞)；在進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天，以 10 倍梯度稀釋慢病毒并分別進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)導(dǎo) 72 小時(shí)后以熒光顯微鏡觀察 GFP 報(bào)告基因表達(dá)情況，確定該細(xì)胞在*轉(zhuǎn)導(dǎo)效果下的慢病毒量。
后，若您的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞要求較高的 MOI 值， 您還可通過以下幾種方法將其降低。方法一是加入 polybrene (hexadimethrine bromide)， 一種能夠減少病毒與細(xì)胞膜間電荷排斥作用的陽離子聚合物。另一種方法是使用能夠捕獲慢病毒顆粒的磁珠(例如，利用磁珠可成功地將 MM-AN 細(xì)胞的 MOI 從 16 降到 4)。購買或構(gòu)建克隆時(shí)，可選擇載體骨架上帶有標(biāo)記基因(如：Puromycin, Neomycin 等)的克隆，可方便后續(xù)進(jìn)行藥物篩選，建立將的基因成功地隨機(jī)整合到特定細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞株。
GeneCopoeia 提供基于慢病毒表達(dá)載體的人源及小鼠源的 ORF, 啟動子，shRNA, pre-miRNA, microRNA inhibitor, 以及 CRISPR sgRNA 表達(dá)克隆(質(zhì)粒)。另外，我們還提供慢病毒包裝服務(wù)、LentiFectTM 慢病毒包裝試劑盒(包含滴度增強(qiáng)劑)，慢病毒濃縮試劑和 EndofectinTM 轉(zhuǎn)染試劑等，實(shí)現(xiàn)一站式慢病毒解決方案。
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