設(shè)計(jì)策略

    PS：該方法適用于檢測或部分 DNA 片段克隆，不適合全長基因克隆

    反轉(zhuǎn)錄 PCR 的主要問題是基因組 DNA （gDNA） 污染的存在，這將導(dǎo)致產(chǎn)生假陽性信號，特異性降低或?qū)μ囟?RNA 的過高估計(jì)。為了消除 RT-PCR 中 gDNA 的干擾，可將引物設(shè)計(jì)為與兩個外顯子的接合部退火，該點(diǎn)為 cDNA 序列專有，因此 gDNA 將不能被擴(kuò)增。

    cDNA 特異的引物可通過三個途徑設(shè)計(jì)（如下圖所示）

    1. 引物橫跨外顯子-外顯子接合部。設(shè)計(jì)的引物如果一半與一個外顯子的 3'端結(jié)合，而 另一半與相鄰?fù)怙@子的 5'端結(jié)合，它將只與 mRNA 或由已剪切的 mRNA 合成的 cDNA 退 火，而不與 gDNA 結(jié)合，因而可以避免對 gDNA 污染的擴(kuò)增。正向或反向引物都可設(shè)計(jì)為 橫跨外顯子接合部；而另一個引物可設(shè)計(jì)為結(jié)合于另一個外顯子接合部或在*位于外顯子 內(nèi)部的位點(diǎn)上。

    2. 外顯子*配對-內(nèi)含子交叉配對引物。為了從 cDNA 和 gDNA 混合物中選擇性地擴(kuò)增 gDNA, 設(shè)計(jì)的引物應(yīng)與外顯子-內(nèi)含子接合部退火，這種引物叫做外顯子*配對-內(nèi)含子交叉配對（exon-primed intron-crossing，EPIC） 引物（Bierneetal. 2000）。EPIC 引物可 在系統(tǒng)發(fā)育研究中用于擴(kuò)增同源的內(nèi)含子區(qū)域，因?yàn)橥怙@子序列相對內(nèi)含子而言更保守。

    3. 引物位于外顯子-外顯子接合部的側(cè)面。設(shè)計(jì)的 RT-PCR 引物位于至少含一個內(nèi)含子 的區(qū)域的側(cè)面。這樣以 cDNA 為模板擴(kuò)增的片段要小于以 gDNA 為模板擴(kuò)增的片段，這種 大小的差異可以幫助檢測 gDNA 污染的存在。