CRISPR/Cas 是進行基因編輯的強大工具，可以對基因進行定點的編輯。在向?qū)?RNA(guide RNA， gRNA)和 Cas9 蛋白的參與下，待編輯的細胞基因組 DNA 將被看作病毒或外源 DNA，被剪切。
一、尋找目的基因的靶標(biāo)
靶點挑選要點：
基因敲除靶點應(yīng)設(shè)計在起始密碼子附近(包括起始密碼子)或者起始密碼子下游的外顯子范圍內(nèi)。
不同 Cas9/gRNA 靶點在基因敲除效率上有較大差異，因此同時設(shè)計構(gòu)建 2～3 個靶點的基因敲除載體再從中選出敲減效果較佳的靶點。
N1-N20 NGG 靠近 PAM 的堿基對靶點的特異性很重要，前 7～12 個堿基的錯配對 Cas9 切割效率影響較小。設(shè)計好的靶點序列應(yīng)在基因庫中進行 BLAST 檢測。
Cas9Nicknase 需要挑選成對的靶點。一般在正義鏈和反義鏈上分別挑選相距 20～30bp 的靶點配對。多對靶點的敲除效率常有較大差異。由于基因敲除實驗時間長，在正式對目的細胞進行敲除前對靶點進行驗證和挑選非常必要。
二、 插入片段設(shè)計
插入寡核苷酸序列設(shè)計(必須 PAGE 純化寡核苷酸)：
正向序列
5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’
反向序列
3’TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’
插入片段的合成
用水將寡核苷酸稀釋為 100 μM。按以下體系配制退火反應(yīng)體系：
正義寡核苷酸(100 μM)5μl
反義寡核苷酸(100 μM)5μl
NaCl 100 mM(終濃度)
Tris‐Cl pH7.4 50 mM(終濃度)
加水補足 50 μl
將配制好的退火反應(yīng)緩沖液重復(fù)混合，短暫離心后放置 PCR 儀上，運行以下程序： 90℃ 4 min， 70℃ 10 min， 55℃ 10 min， 40℃ 10 min， 25℃ 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在 ‐20℃ *保存。
三、 pCas9/gRNA 基因敲除載體的構(gòu)建
用 EcoRV 酶切 2 μg pCas9/gRNA 載體(inovogen)。通常情況下用大約 20～30 單位的酶大約 3 小時可以酶切*。酶切后我們建議用瓊脂糖凝膠回收線性化載體。將回收后的線性化載體定量，通常線性化載體的工作濃度為 50～100ng/μl。連接用水將退火后雙鏈寡核苷酸 (10 μM) 稀釋 100 倍備用。
連接反應(yīng)體系：
T4 DNA 連接酶 5U
EcoRV 5U
線性化載體 2 μl
稀釋 100 倍后雙鏈寡核苷酸 1 μl
10× 連接酶 Buffer 1 μl
50% PEG4000 1 μl
加水補足 10 μl
反應(yīng)條件： 22℃ 30 min， 37℃ 15 min。
注：
平末端連接效率較低，在連接體系中添加 PEG4000 可以提高連接效率。
在連接體系中添加 EcoRV 酶可以顯著提**性率。
四、 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞及通過載體上的引物進行 PCR 鑒定陽性克隆
挑選陽性克隆進行測序驗證, 驗證正確后, 提取質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染試驗, 關(guān)于 sgRNA 是否有效。可以轉(zhuǎn)染之后，直接提取 DNA，通過測序驗證，如果在靶標(biāo)位點附近開始出現(xiàn)雜亂的多峰說明是 sgRNA 有效，如果沒有則該 sgRNA 無效。
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