一、原理
也是通過限制性內(nèi)切酶片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。但AFLP是通過PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增，然后把擴(kuò)增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳，多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)。實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接，連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)需要通過選擇在末端上分別填加了1～3個(gè)選擇性核苷的不同引物，可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的內(nèi)切酶片段，進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致特異性擴(kuò)增。
二、實(shí)驗(yàn)試劑
酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接頭、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、瓊脂、過硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸銀、甲酰胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、
三、操作步驟
(一) 基因組DNA提取和純化
、參考實(shí)驗(yàn)一的大量提取DNA實(shí)驗(yàn)方法，
、DNA的純化：用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)電泳檢測(cè)片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化，首先用TE緩沖液補(bǔ)滿至總體積50ul，再等體積苯酚//異戊醇(25：24：1)、/異戊醇(24∶1)各抽提一次， 離心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，-20℃放置2h以上，10000g離心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，風(fēng)干后溶于30μlTE緩沖液中，UV-2401PC(島津)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)電泳檢測(cè)片段大小。
注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300ul，此時(shí)DNA濃度大約為100ng/ul。
(二)限制性酶切及連接
在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng，2.5μl 10×酶切緩沖液， 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4連接酶，50pmol MseⅠ接頭(序列見表2)，雙蒸水補(bǔ)至25μl。用PE公司PCR擴(kuò)增儀設(shè)定37℃過夜反應(yīng)后，于65℃20min滅酶活，-20℃保存，作為預(yù)擴(kuò)增模板。
(三)預(yù)擴(kuò)增
取3μl酶切連接產(chǎn)物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30循環(huán)；72℃10min(PE公司PCR儀)。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB0。5μg/ml)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖①)，取3μl產(chǎn)物釋稀50倍，用作選擇性擴(kuò)增模板。
(四)選擇性PCR擴(kuò)增
取釋稀后的產(chǎn)物3μl，加入EcoRⅠ選擇性引物、MseⅠ選擇性引物各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13循環(huán)(每循環(huán)降0。7℃)；94℃30s， 56℃1min，72℃1min，25循環(huán)；72℃5min(PE公司PCR儀)，先用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)電泳檢測(cè)先擇性擴(kuò)增產(chǎn)物。
(五)凝膠電泳
擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠(厚度0.5mm)和1×TBE電泳緩沖液電泳分離(BIO-RAD公司測(cè)序電泳儀)。拔出梳子，140W恒功率預(yù)電泳30分鐘，溫度達(dá)到47～49℃。務(wù)必使每個(gè)孔清洗出尿素。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液(98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍(lán))94℃變性5min(PE公司PCR儀)，結(jié)束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣。每個(gè)泳道加樣8μl。一開始用100W恒功率電泳約2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調(diào)到60W恒功率電泳，溫度保持在43℃左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處，結(jié)束電泳。
(六)銀染
固定液：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去離子水至1L。顯色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。
?、?電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中。
?、?固定：加入固定液，在搖床上輕微震蕩30min。固定結(jié)束后，固定液保留。
?、?加入去離子水漂洗3次，每次2min。
?、?染色：將凝膠放入染色盤中，倒入染色液(4℃)，在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后，置入顯色盤中。
?、?顯色：加入顯色液(4℃)，在搖床上輕微震蕩直至條帶數(shù)不再增加為止。
⑥ 終止：加入b步驟用后的固定液，來(lái)回漂幾分鐘。達(dá)到效果后，用蒸餾水漂洗幾分鐘。
?、?去除凝膠和玻璃板上的水珠后，放在白光燈箱上用Nikon數(shù)碼相機(jī)拍照。
(七)數(shù)據(jù)分析
用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統(tǒng)計(jì)，再用NTSYS軟件計(jì)算出遺傳相似性系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析構(gòu)建聚類圖。
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