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 WB實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的樣品制備和蛋白質(zhì)定量，你了解多少？

南京信帆生物提供 western blot實(shí)驗(yàn)代測(cè)服務(wù)！

 western blot實(shí)驗(yàn)很常規(guī)，但是對(duì)于初學(xué)者來(lái)說(shuō)蛋白質(zhì)樣品的制備和定量是非常關(guān)鍵的，但是你又了解多少呢？讓我們跟著南京信帆生物的技術(shù)來(lái)揭開它神秘的面紗，讓我們都清楚的了解和掌握它吧！

 

一、蛋白質(zhì)的樣品制備：

 

由于這一步方法各異，具體步驟請(qǐng)參考試劑盒的說(shuō)明書即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的*步，樣品制備是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應(yīng)注意以下問(wèn)題:

 

> 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的大溶解性和可重復(fù)性。

 

> 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。

 

> 防止蛋白質(zhì)在樣品處理過(guò)程中的人為的修飾，制備過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。

 

> 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測(cè)蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80℃中*保存，但要注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀?huì)使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。

 

> 若蛋白提取過(guò)程存在問(wèn)題或蛋白發(fā)生降解則很難進(jìn)行好之后的實(shí)驗(yàn)，也就很難做出好的結(jié)果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)也應(yīng)注意將樣品與loading buffer混合均勻。

 

二、蛋白質(zhì)定量

 

如果要定量的話，一般選擇BCA或者Bradford方法，BCA要求檢測(cè)波長(zhǎng)為562nm，Bradford為595nm。具體方法見各試劑盒說(shuō)明書。為避免假陽(yáng)性結(jié)果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬G250混合看是否產(chǎn)生顏色。測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含50~100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你膠每個(gè)泳道大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣量不宜過(guò)大）。

網(wǎng)上有人喜歡等質(zhì)量上樣（即每個(gè)泳道的上樣體積不一但質(zhì)量一定），也有使用等體積上樣（即先把各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)量上樣，計(jì)算上樣體積時(shí)需包含loading buffer的體積）。按分子克隆的說(shuō)法，還是使用等體積上樣比較好。

上樣總體積一般不超過(guò)15ul，加樣孔的大限度可加20ul樣品。上樣前要將樣品置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮3~5min使蛋白充分變性。也可以使用PCR儀95°加熱5min，效果佳，操作方便。之后樣品可以在4℃冰箱短時(shí)間保存，也可在-20°冰箱保存數(shù)月，但是反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。

通過(guò)上面的介紹，是不是對(duì)于WB實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的樣品制備和蛋白質(zhì)定量，你有了更深一步的了解呢？希望在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，大家都可以一切順利，做出漂亮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)圖片！

 WB實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的樣品制備和蛋白質(zhì)定量，你了解多少？