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*分型檢測試劑盒

SET A,B,C,D,E

*分型檢測試劑盒1．概述

 *分型檢測試劑盒SET A，B,C,D,E,采用三明治（夾心）酶聯(lián)免疫反應(yīng)法檢測固態(tài)和液態(tài)食品及細(xì)菌培養(yǎng)物中的*腸毒素（SET）A，B，C，D，E。

葡萄球菌屬于微球菌屬。*和豬葡萄球菌可制造一種或多種耐熱的腸毒素。這些腸毒素可引致食物中毒。

除沙門氏菌外，*是產(chǎn)生腸毒素并導(dǎo)致食物中毒的主要元兇之一。一般來說，每克食品中5 x 105個(gè)產(chǎn)毒素的*可導(dǎo)致中毒。然而，一些研究也顯示，僅100 - 200 ng的葡萄球菌腸毒素量便可引致中毒癥狀。*腸毒素常存于意大利面、肉制成品、奶、奶產(chǎn)品、冰淇淋、蛋類產(chǎn)品、沙拉、面包、蛋糕、餡餅及由這些產(chǎn)品制備而成的其他食品中。其中血清型為A，B，C，D和E 的腸毒素尤為嚴(yán)重。該試劑盒特點(diǎn)包括：

• 簡單的前處理方法（離心）。
• 低檢測限（0.25ng/ml）。
• 快速的ELISA檢測方法（在不考慮樣品數(shù)量下只需不到3小時(shí)）。

 

*分型檢測試劑盒2．試劑盒原理

 *分型檢測試劑盒，檢測的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板A - E孔和H孔包被有針對葡萄球菌腸毒素A，B，C，D和E的特異性抗體。F和G孔包被有針對無免疫動物的抗體（質(zhì)控）。加入樣品溶液至孔A至G（和微孔板架上的標(biāo)記一致），加入陽性質(zhì)控至孔H。見附錄1。樣品溶液中可能含有的毒素會對應(yīng)的捕獲抗體結(jié)合。沒有結(jié)合的部分會在洗滌步驟中被除去。通過加入針對葡萄球菌腸毒素的*酶標(biāo)記的抗SET抗體酶連接物可以與板上固定結(jié)合的腸毒素連接。未連接的酶連接物在洗滌過程中被除去。加入鏈霉親和素POD，孵育后洗板。然后加入底物/發(fā)色劑。結(jié)合在一起的鏈霉親和素POD酶連接物將無色發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)終止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450/630 ± 10 nm 處測量。吸光度值與樣品中的葡萄球菌腸毒素濃度成正比。

 

1. 試劑盒組成

內(nèi)容物	規(guī)格	保存
金葡抗體包被板(Anti- Coated Plate)	96孔板（12×8 孔）	2-8℃
陽性質(zhì)控（Positive Control）	2.0mL	2-8℃
酶連接物I(HRP-conjuge I)	12mL	2-8℃
酶連接物II（HRP-conjuge II）	12mL	2-8℃
10×濃縮洗液(Wash Solution)	25mL	2-8℃
終止液(Stop Buffer)	14mL	2-8℃
TMB底物(Tmb Substrate)	14mL	2-8℃

 本試劑盒應(yīng)當(dāng)在2-8℃的溫度下儲存，有效期為一年。

*分型檢測試劑盒

4.檢測限

檢測物質(zhì)	檢測下限（ng/ml）
液態(tài)樣品	0.25
固態(tài)樣品	0.625
細(xì)菌培養(yǎng)液	0.25

 

5．其他需要而本試劑盒未提的設(shè)備或材料

• 酶標(biāo)儀(450nm)
• 恒溫培養(yǎng)箱
• 勻質(zhì)器
• 漩渦振蕩器
• 微量加樣器(10、20、100和1000mL各一支)
• 多道槍：50-300mL

 

6.注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)前請閱讀以下文字，以保證獲得實(shí)驗(yàn)效果。

• 陽性質(zhì)控含有葡萄球菌腸毒素，對健康有危害，因此應(yīng)避免皮膚接觸和滴入口中。
• 所有與陽性質(zhì)控接觸過的材料必須小心處理，被污染的玻璃器皿需要用次氯酸鈉（10 %（v/v））浸泡過夜（pH值要用HCl溶液調(diào)整至7）。
• 陽性質(zhì)控還包含疊氮鈉，也需特別注意。
• 反應(yīng)終止液含1 N硫酸
• 保存試劑盒于 2 - 8 °C，不要冷凍。
• 將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封儲存于2 - 8 °C條件下。
• 無色發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 對過了有效期（見試劑盒外標(biāo)簽有效期）的試劑盒不再提供任何質(zhì)量保證。
• 若對試劑盒中的反應(yīng)液進(jìn)行了稀釋，或?qū)嶒?yàn)室器材未*清潔，則可能影響本檢測的靈敏度。
• 不能交叉使用不同批號的盒中試劑。

 

7．樣品的準(zhǔn)備

樣品保存在2-4℃不超過1-2天，如果需要保存較長的時(shí)間，應(yīng)該放置-20℃。樣品使用前應(yīng)恢復(fù)到室溫。

1）牛奶

• 奶類樣品（10 - 25 ml），特別是原奶樣品，在低溫條件下離心：10 min / 3500 g / 10 °C（若沒有條件進(jìn)行低溫離心，則在離心前將樣品冷藏降溫）。
• *去除（吸?。┥蠈又緦?。
• 每孔取100 µl進(jìn)行檢測 。

2）面條和大米（煮好的），肉類、冰激淋、快餐和其他脂肪含量小于40 %的食品樣品

•  取10 - 25 g樣品粉碎，按照每克樣品1.5 ml PBS緩沖液（PH值7.4）的比例進(jìn)行混合（例如10 g 樣品 + 15 ml 緩沖液）
• 振蕩15分鐘
• 離心：10 min / 3500 g / 10 °C
• 據(jù)情況除去上層脂肪
• 每孔取100 µl進(jìn)行檢測

 

3）脂肪含量大于40 %的食品樣品

• 取10 - 25 g樣品粉碎，按照每克樣品1.5 ml PBS緩沖液（PH值7.4）的比例進(jìn)行混合（例如10 g 樣品 + 15 ml 緩沖液）
• 振蕩15分鐘
• 離心：10 min / 3500 g / 10 °C
• 取其5 ml上清液于另一離心管中，加入5 ml正庚烷，充分混合5分鐘
• 離心：5 min / 3500 g / 10 °C
• *去除上層庚烷層，不能含有任何庚烷殘留，將足夠用的下層水相轉(zhuǎn)移到另一新的干凈試管中
• 每孔取100 µl進(jìn)行檢測

   

8．酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試步驟

試劑準(zhǔn)備

注意：試劑在使用之前要在室溫下解凍1-2小時(shí)，確定在使用前閱讀過注意事項(xiàng)。準(zhǔn)備適量的檢測用試劑，所有的試劑搖勻后使用。準(zhǔn)備足夠所有小管所需的用量，不能將試劑倒回原來的瓶子中，處理試劑時(shí)建議用廢棄的瓶子以降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。

1x洗液的制備

1體積的10x洗液同9體積的蒸餾水混合

*分型檢測試劑盒檢測：

• 將所需數(shù)量的微孔板條插到微孔板架上。一個(gè)樣品需要一整條微孔板條。
• 按微孔板架上的標(biāo)記向A到G孔里添加100 µl處理好的樣品，向H孔里添加100 µl陽性質(zhì)控。輕輕混勻，覆蓋微孔板后，在35 - 37 °C條件下孵育1小時(shí)。
• 倒出孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證*除去孔中的液體。使用多級移液器向每孔加入300 µl洗滌緩沖液洗滌微孔。上述操作再重復(fù)進(jìn)行四遍。
• 向每一個(gè)微孔中加入100 µl酶連接物I溶液，充分混合，覆蓋微孔板后，在35 - 37 °C條件下繼續(xù)孵育1小時(shí)。
• 倒出孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證*除去孔中的液體。使用多級移液器向每孔加入300 µl洗滌緩沖液洗滌微孔。上述操作再重復(fù)進(jìn)行四遍。
• 向每一個(gè)微孔中加入100 µl酶連接物II溶液，充分混合，覆蓋微孔板后，在35 - 37 °C條件下繼續(xù)孵育30分鐘。
• 倒出孔中的液體，將微孔板架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證*除去孔中的液體。使用多級移液器向每孔加入300 µl洗滌緩沖液洗滌微孔。上述操作再重復(fù)進(jìn)行四遍。
• 向每一個(gè)微孔中加入100 µl 底物，充分混合，覆蓋微孔板后，在35 - 37 °C條件下繼續(xù)孵育15分鐘。
• 向每一個(gè)微孔中加入100 µl 反應(yīng)終止液，充分混合。在加入反應(yīng)終止液后30 分鐘內(nèi)于450/630 ± 10 nm 處測量吸光度值。

 

9. 結(jié)果計(jì)算

1. 臨界值的計(jì)算

   計(jì)算每個(gè)樣品F和G孔中的陰性質(zhì)控的吸光度值平均值。臨界值通過平均值加上0.15得到。  

            舉例：    陰性質(zhì)控1（微孔F） = 0.008

                      陰性質(zhì)控2（微孔G）= 0.010

 

                  平均值 = 0.009  

                   臨界值 = 0.009 + 0.15 = 0.159

 2. 檢測質(zhì)控

         陽性質(zhì)控的吸光度值應(yīng)大于或等于1.0。

         陰性質(zhì)控吸光度值的平均值應(yīng)小于或等于0.2。

         只有在滿足第1和第2點(diǎn)的前提條件下，才應(yīng)進(jìn)行結(jié)果評估。

 3. 結(jié)果分析

      1. 如果樣品在450/630 ± 10 nm處的吸光度值小于臨界值，為陰性結(jié)果。

      2. 如果樣品在450/630 ± 10 nm處的吸光度值大于或等于臨界值，為陽性結(jié)果。

 

 

附錄I