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公司動(dòng)態(tài)

慢病毒的相關(guān)操作方法與問題解答

閱讀:45          發(fā)布時(shí)間:2021-7-20

慢病毒(Lentivirus)是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體,它可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞,可有效地感染包括幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞和原代細(xì)胞。此外,慢病毒具有嗜核性,可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而可以在體內(nèi)較長(zhǎng)期表達(dá)。慢病毒的多種優(yōu)點(diǎn),使它成為基因傳遞的強(qiáng)大而有效的工具,獲得了廣泛的應(yīng)用。因此,慢病毒成為了實(shí)驗(yàn)室的一大常客。在使用慢病毒的過程中,我們會(huì)遇到一些問題,比如細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低,細(xì)胞狀態(tài)差等等。為了在實(shí)驗(yàn)過程中更好地使用慢病毒,我們應(yīng)該注意哪些問題呢?

慢病毒載體是經(jīng)過處理的HIV,理論上對(duì)人體是無害的,但病毒仍然具有潛在的生物學(xué)危險(xiǎn),慢病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)需要在生物安全柜(BL-2級(jí)別)內(nèi)進(jìn)行操作。因此在進(jìn)行操作的時(shí)候,我們要按照如下基礎(chǔ)規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn):

1、在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作時(shí),穿著實(shí)驗(yàn)服或隔離服,戴上手套和kou罩;

2、操作病毒時(shí)請(qǐng)盡量使用生物安全柜,小心不要產(chǎn)生氣霧或液體飛濺;

3、如果使用普通超凈工作臺(tái)操作病毒,請(qǐng)?jiān)诖蜷_含you病毒的容器蓋子前關(guān)閉超凈臺(tái)的風(fēng)機(jī)(由于超凈臺(tái)風(fēng)向外排,有可能將病毒吹向操作者),并盡快操作;盡量縮短開蓋后的病毒在關(guān)閉了排風(fēng)機(jī)的超凈臺(tái)中停留的時(shí)間,封閉所有含you病毒的容器、耗材、廢液后,再打開超凈臺(tái)風(fēng)機(jī);

4、如果操作時(shí)臺(tái)面you病毒污染,請(qǐng)立即用75%酒精加1%的SDS 溶液擦拭。接觸過病毒的槍頭,離心管,培養(yǎng)板,培養(yǎng)液請(qǐng)用75%酒精加1%的SDS 溶液或于84 消毒液浸泡過夜后棄去;

5、如需離心,應(yīng)使用密封性好的離心管,或用封口膜封口后離心;

6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束,脫掉手套前先消毒再摘除手套,隨后用肥皂洗手。

慢病毒的儲(chǔ)存與稀釋

1、病毒長(zhǎng)期儲(chǔ)存于-80℃冰箱,-20℃保存不要超過1周,4℃保存不要超過3天;

2、病毒的運(yùn)輸采用干冰,收到病毒液后若幾天內(nèi)用于實(shí)驗(yàn),可于4℃保存(于3天內(nèi)用完)。若短時(shí)間內(nèi)不用,收到病毒后應(yīng)立即放入-80℃冰箱進(jìn)行長(zhǎng)期保存。病毒使用過程中要避免反復(fù)凍融,否則會(huì)降低病毒滴度;

3、一般病毒可在-80℃存放1年,但存放時(shí)間超過6個(gè)月后使用,需重新檢測(cè)病毒滴度;

4、需要稀釋病毒時(shí),將病毒從-80℃冰箱中取出,置于冰上溶解,然后用PBS或培養(yǎng)基(不含血清)稀釋到所需濃度后輕柔混勻,盡快使用;

慢病毒的使用

預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索慢病毒的最佳MOI

每種細(xì)胞對(duì)慢病毒的敏感性不同,有些容易感染,有些不容易感染,不同慢病毒的熒光強(qiáng)度也有差異,所以進(jìn)行慢病毒操作實(shí)驗(yàn)之前,首先要了解MOI的概念,MOI(Multiplicity of Infection,感染復(fù)數(shù))是指病毒感染細(xì)胞的比例。

選擇合適的MOI值,病毒的感染效率以及目的蛋白的表達(dá)量越高,相對(duì)細(xì)胞的毒性越小。對(duì)于分裂活躍的細(xì)胞,比如293細(xì)胞MOI=1時(shí),95%以上的細(xì)胞均可以表達(dá)目的基因。而對(duì)于非分裂細(xì)胞,比如原代細(xì)胞,感染效率較低,MOI值可能達(dá)到200-300。我們建議通過比較不同MOI(比如0、1、5、10、50、100等)感染細(xì)胞MOI值的摸索。

1、感染前一天,一般用24孔板接種2×10?個(gè)細(xì)胞,第二天病毒感染時(shí)的細(xì)胞匯合度達(dá)到40-50%左右;

2、MOI值的設(shè)置若有文獻(xiàn)參考,可以參考值為中心設(shè)置梯度覆蓋參考值,舉例:文獻(xiàn)中某細(xì)胞系慢病毒MOI值為10,則設(shè)置MOI梯度為2.5,5,10,20,40等;若無文獻(xiàn)參考可按10倍梯度稀釋進(jìn)行設(shè)置,每個(gè)梯度3次重復(fù);

注:(1)每孔加病毒量(μL)=MOI*細(xì)胞數(shù)/滴度(TU/mL)*10?

一般第二天按照細(xì)胞數(shù)倍增計(jì)算;如果病毒滴度很高,每孔加病毒量過少,可進(jìn)行稀釋后再加;Polybrene(常用濃度為5-10μg/mL)是否添加根據(jù)細(xì)胞種類及具體實(shí)驗(yàn)決定;

3、第三天(加病毒后12h-24h左右),棄去含病毒就培養(yǎng)基,更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);

4、第五天,觀察熒光情況,并進(jìn)行拍照,確定蕞適合MOI值;

5、對(duì)于生長(zhǎng)緩慢代謝慢的細(xì)胞,可以適當(dāng)延長(zhǎng)病毒感染時(shí)間,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)決定何時(shí)更換培養(yǎng)基,保持細(xì)胞的活性。

慢病毒感染目的細(xì)胞

1、通過感染預(yù)實(shí)驗(yàn),確定細(xì)胞接種密度、最佳MOI等條件。正式實(shí)驗(yàn)前,調(diào)整并保持良好的細(xì)胞狀態(tài);

2、按實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞鋪板(qPCR檢測(cè)用12孔板,WB檢測(cè)用6孔板或更大面積的培養(yǎng)皿),細(xì)胞數(shù)以第2天密度約40-50%為宜,37℃ 培養(yǎng)過夜;

3、感染前,從-80℃冰箱取出病毒置于冰上融化,用PBS稀釋成所需濃度,用移液器吹打均勻;

4、感染前給細(xì)胞換液,然后向每孔中均勻滴加稀釋好的病毒液,輕輕搖勻,37℃培養(yǎng)過夜;

5、感染后根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)決定,更換新鮮的*培養(yǎng)液,繼續(xù)37℃培養(yǎng)。若病毒對(duì)細(xì)胞無毒性也可不換液。感染后48-72h觀測(cè)熒光,拍照記錄;

6、根據(jù)需要,或收細(xì)胞抽提RNA檢測(cè)目的基因在mRNA水平的表達(dá),或收細(xì)胞抽提蛋白檢測(cè)目的蛋白的表達(dá),或收細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞功能檢測(cè);

7、在培養(yǎng)過程中,需要篩選穩(wěn)定攜帶 Puromycin 抗性基因的病毒,則需換上含適當(dāng)濃度 Puromycin 的新鮮*培養(yǎng)液。

 

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