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PCR引物設(shè)計(jì)八點(diǎn)決竅

（1）引物長度
        引物長度對反應(yīng)特異性、解鏈溫度、退火時(shí)間都有較大的影響，zui終影響到 PCR 反應(yīng)是否成功。多數(shù)情況下，引物長度約 18~30bp, 引物太短會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增，太長雖然會(huì)增加特異性，但是二級結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)）出現(xiàn)的概率增大。
（2）引物的解鏈溫度
        PCR 反應(yīng)的特異性很大程度上依賴于引物的解鏈溫度（Tm 值）。多數(shù) PCR 反應(yīng)*的 解鏈溫度應(yīng)在 55~60℃，如果沒有其他不穩(wěn)定因素，引物的 Tm 值取決于它的長度、序列組成和濃度，離子強(qiáng)度的影響可以忽略不計(jì)，因?yàn)椴煌?PCR 反應(yīng)鹽濃度變化不大。
        一個(gè)反應(yīng)中所有引物的解鏈溫度應(yīng)盡可能接近。對于多數(shù) PCR 反應(yīng)而言，引物之間的差應(yīng)小于 2~3℃。差值增大，反應(yīng)效率會(huì)降低，甚至直接導(dǎo)致反應(yīng)失敗。因?yàn)?Tm 值髙 的引物在低于退火溫度的條件下錯(cuò)配，而 Tm 值低的引物在髙于退火溫度的條件下與模板只有低濃度結(jié)合。
        可利用以zui近鄰熱力學(xué)理論為基礎(chǔ)的公式估算 Tm 值，該理論分析了復(fù)式解鏈的熱力學(xué)過程。
Tm = [△H/△S-RIn(c)]-273.15（公式 1）
復(fù)式構(gòu)成物中焓變（△H）和熵變（△S ）可借助于zui近鄰熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算，為摩爾氣體常數(shù)，c 為寡核苷酸的物質(zhì)的量濃度。該分析可確定特定的焓和熵對復(fù)式構(gòu)成物的自由能 的影響，該影響由序列中的「zui近鄰」造成。zui近鄰從 5 末端起始，焓和熵的效應(yīng)是加性的。在式（1）中加人另一個(gè)條件，以經(jīng)驗(yàn)性地計(jì)算鹽對復(fù)式構(gòu)成物的穩(wěn)定性的影響。