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上海雅吉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 免疫組化試劑盒，對照品，抗體，細胞血清，Elisa試劑盒 |
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2016-9-20 閱讀(286)
實驗方法原理 采用標記有雌二醇單克隆抗體的膠體金顆粒與相對應的固定在硝酸纖維膜上的雌二醇結(jié)合物相結(jié)合，固定有雌二醇結(jié)合物的檢測線處就顯現(xiàn)明顯的顏色。
實驗材料
雌二醇抗體
試劑、試劑盒
氯金酸牛血清白蛋白卵清白蛋白兔抗鼠多抗雌二醇
儀器、耗材
硝酸纖維膜玻璃纖維膜分光光度計低溫高速離心機點膜機
實驗步驟
一、試劑與儀器
氯金酸；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗；雌二醇標準品、雌二醇單抗、17β-Estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)。硝酸纖維膜、玻璃纖維膜；Beckman Du530分光光度計；低溫高速離心機；點膜機。
二、 方法
1. 膠體金的制備
用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為01g/L,*行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100 ml加入1%檸檬酸三鈉25ml，再沸水浴下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩(wěn)定，繼續(xù)沸水浴10 min，冷卻至室溫后，用透射電鏡鏡檢并用分光光度計檢測顆粒均勻度及粒度。zui后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2. zui適標記蛋白量的確定
用0.2mol/L K2CO3將膠體金溶液調(diào)至pH為8.2，然后取試管9支，分別加入10 ml膠體金溶液。將雌二醇抗體逐級稀釋后，各取等體積稀釋液順序加入上述試管中，混勻，另設一不加抗體的對照管。放置10 min，在各管中加入0.1 ml的10% NaCl，混勻后靜置2 h。觀察各管中膠體金溶液變化，未加蛋白及加入量不足的溶液顏色由紅變藍，而加入蛋白量達到或超過時的溶液則保持不變。標記蛋白量即為zui低穩(wěn)定膠體金溶液不變色的蛋白量基礎上再加20%。
3. 膠體金探針的標記
將抗體用0005mol NaCl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉淀，調(diào)至05mg/ml。取膠體金100 ml，用0.2 mol/L K2CO3將膠體金溶液調(diào)至pH為9.0，磁力快速攪拌下緩慢加入24 ml稀釋的雌二醇抗體，繼續(xù)攪拌10 min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其zui終濃度為1%，再攪拌10 min。將初步制得的膠體金探針以4 000 r/mm離心20 min；棄沉淀，上清以10 000 r/min離心60 min；棄上清，沉淀用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(含1%牛血清白蛋白)重新懸?。煌半x心洗滌2次，將沉淀用0.1 mol/L的PBS(pH82，含1%BSA，002%NaN3)懸浮，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
4. 抗原的合成
小分子物質(zhì)難以固定在硝酸纖維膜上，只有使它連上大分子物質(zhì)才能較好地固定。本實驗采用混合酸酐法制備*抗原。雌二醇-6-肟 43 mg，加入三正丁胺5 μl，二氧六環(huán)4 ml，冰浴冷卻到10℃以下，加入5 μl。4～10℃下反應30 min。配制卵清白蛋白(OVA)溶液(OVA 10 mg，3ml水，3 ml二氧六環(huán)，1mol/L氫氧化鈉03ml)。將配制好的OVA溶液加入反應液，4℃冰浴攪拌6h，反應過程中，用氫氧化鈉維持pH值為8.反應完畢后，將反應液加入透析袋，透析2 d。將透析液調(diào)至pH4.5，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉淀出現(xiàn)。離心收集沉淀，冷凍干燥，4℃冰箱保存。將OVA溶于透析液內(nèi)作為參比，用紫外光譜法對雌二醇-6肟-OVA進行定性檢驗。經(jīng)紫外測定證明蛋白質(zhì)已與雌二醇衍生物結(jié)合。
5. 膠體金免疫層析試紙條制備
測試條由玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、加樣紙、吸水紙4部分組成。將玻璃纖維膜裁成6mm的細條，然后放入含1% BSA、1%Tween-20的PB液中浸泡30 min，37℃烘干，zui后將膠體金探針灌注已處理好的玻璃纖維膜上，真空干燥備用。在硝酸纖維膜上用點膜機將上述抗原和兔抗鼠IgG噴成2條線，分別為檢測線和對照線，經(jīng)真空干燥后，用1% BSA、0.1mol/L PBS（pH9.0)封閉2 h，以0.1 mol/L PBS洗滌，再真空干燥。將30 mm吸水紙、25 mm硝酸纖維膜、6 mm玻璃纖維膜、15 mm加樣紙，由頂部依次粘于PVC板上，裁成細條備用。
6. 檢測與判讀樣品
含已知濃度雌二醇樣品的乙醇溶液分為3組，第1組不加雌二醇，第2組為0.2 μg/ml雌二醇，第3組為0.4 μg/ml雌二醇。將加樣紙一端插入待測液，濕潤后取出，水平放置，約3～5 min，觀察結(jié)果。如試紙條硝酸纖維膜上僅對照線呈一條紫紅色帶為陽性；如出現(xiàn)2條紫紅色帶為陰性；如質(zhì)控線不出現(xiàn)紫紅色帶，無論檢測線是否出現(xiàn)，測試結(jié)果均無效。
