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【化工機械設(shè)備網(wǎng) 技術(shù)前沿】近期，中國科學院深圳先進技術(shù)研究院聯(lián)合中國醫(yī)學科學院的研究團隊依托深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施開發(fā)了無標記質(zhì)譜篩選技術(shù)，可應(yīng)用于環(huán)二肽合酶的定向進化改造。研究成果以論文形式發(fā)表于國際學術(shù)期刊Chemical Science。
酶是天然催化劑，酶催化在精細化學品、醫(yī)藥中間體合成等方面有著重要作用，可以替代了傳統(tǒng)化學中一些需要重金屬參與且高耗能的生產(chǎn)過程。然而酶是生命體代謝反應(yīng)的承擔者，為了執(zhí)行生物體內(nèi)的相應(yīng)過程而產(chǎn)生，一旦脫離了原始的生物體環(huán)境，酶的穩(wěn)定性、催化活性以及選擇性等將會受到極大影響；而且單一的酶往往局限在單一的底物，難以普適使用。而酶的定向進化就是這些問題的解決方法。
定向進化通過隨機突變和重組，人為制造大量突變，按照特定的需要和目的給予選擇壓力，篩選出具有期望特征的蛋白質(zhì)，實現(xiàn)分子水平的模擬進化，需要開展反復多輪的突變文庫構(gòu)建和篩選?，F(xiàn)有面向酶定向進化的高通量篩選方法，通常利用偶聯(lián)反應(yīng)、生物傳感器等手段，將底物或產(chǎn)物濃度信息轉(zhuǎn)化成光學、電化學等信號。質(zhì)譜分析與現(xiàn)有的幾種方法相比具有更好的普適性，而且基于無標記(label-free)原理，可以通過非靶向質(zhì)譜方法識別新的酶促產(chǎn)物，從而發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的新催化活性。
質(zhì)譜篩選酶定向進化中的應(yīng)用存在樣品制備和色譜分離步驟耗時長的問題。研究團隊依托深圳合成生物大設(shè)施的機器人平臺，針對酶突變文庫構(gòu)建和篩選過程中的不同環(huán)節(jié)，開發(fā)了對應(yīng)的自動化流程和方法，通量為每樣品5秒鐘，實現(xiàn)了微生物發(fā)酵產(chǎn)物的無標記質(zhì)譜篩選。
研究團隊以環(huán)二肽合酶的定向進化驗證無標記質(zhì)譜篩選的功能。以鏈霉菌Streptomyces noursei來源的AlbC作為研究模型，使用大腸桿菌底盤進行文庫構(gòu)建與篩選。重組表達野生型AlbC的大腸桿菌的主要環(huán)二肽產(chǎn)物為cFL。在實驗中，研究者以無標記質(zhì)譜篩選技術(shù)首次對選取的14個位點的266個可能突變體中的238個進行了系統(tǒng)性表征，大大拓展了環(huán)二肽酶關(guān)鍵位點的突變效應(yīng)數(shù)據(jù)，并篩選得到3個突變體。與野生型相比，這3個突變體新的產(chǎn)物鑒定為cFV，驗證了無標記質(zhì)譜篩選技術(shù)在酶新催化活性的定向進化研究中的應(yīng)用。
研究人員表示未來發(fā)展方向包括進一步提高篩選通量、擴大適用分子范圍、對接不同類型質(zhì)譜儀等。
編輯點評：酶催化具有專一性，反應(yīng)條件又溫和，反應(yīng)過程中副反應(yīng)少，生產(chǎn)的效率高。在工業(yè)生產(chǎn)中用酶催化代替化學反應(yīng)不但可以大幅提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本，而且反應(yīng)產(chǎn)生廢棄物和副產(chǎn)物少，環(huán)境污染小?？梢哉f酶催化是很多工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域未來的發(fā)展方向。這項研究開發(fā)的技術(shù)為酶定向進化的篩選提供了一種新的方法，對于人工酶的合成將提供巨大幫助，有利于擴大酶催化在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
(資料來源：中國科學院深圳先進技術(shù)研究院合成生物學研究所)
原標題：我國團隊開發(fā)無標記質(zhì)譜篩選技術(shù) 賦能新酶活定向進化
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