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DNA化學(xué)合成基因

2011-03-28 12:00:59上海勁馬生物科技有限公司閱讀量:1582 我要評(píng)論


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目前有許多基因和蛋白質(zhì)的核苷酸和氨基酸序列已得到闡明,人們已經(jīng)可以根據(jù)需要合成出具有實(shí)際應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值的多肽和蛋白質(zhì)基因。已報(bào)道的合成基因有人生長(zhǎng)激素、干擾素、胰島素、表皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素II、集落刺激因子等,這些基因均已被克隆,絕大多數(shù)已在原核和真核系統(tǒng)中獲得表達(dá)。我國(guó)上海生物化學(xué)研究所等單位于19841年在世界上合成了具有生物學(xué)活性的酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸,為人類(lèi)文明作出了應(yīng)用的貢獻(xiàn)。
  目前,合成基因的方式有2種。①全基因合成:一般對(duì)于分子較小而又不易得到的基因采用該方式。可將雙鏈基因分成若干寡核苷酸單鏈片段(尤其待合成基在在100個(gè)核苷酸以上時(shí)),每個(gè)片段長(zhǎng)度控制在40~60個(gè)堿基,并使每對(duì)相鄰互補(bǔ)的片段之間有~6個(gè)堿基交叉重疊。在體外將除基因兩端末端外的所有片段磷酸化?;旌贤嘶鸷蠹尤隓NA連接酶,即可得到較大的基因片段。如果需連接亞克隆的方法,后將亞克隆的較大片段重組為完整的基因。采用分步連接、亞克隆的方法時(shí),為便于亞克隆中回收基因片段。應(yīng)在片段兩側(cè)設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn),由于每個(gè)亞克隆可以分別鑒定,從而可減少順序錯(cuò)誤的可能性。②酶促合成:此法又稱基因的半合成。全基因,特別是較大的基因的全部化學(xué)合成成本昂貴,使用半合成的方法可以降低成本,從而利于普及使用。首先合成末端之間有10~14個(gè)互補(bǔ)堿基的寡核苷酸片段,退火后以重疊區(qū)作為引物,在4種dNTP存在的條件下,通過(guò)DNA聚合酶I大片段(Klenow酶)或反轉(zhuǎn)錄酶的作用,獲得兩條完整的互補(bǔ)雙鏈。在合成基因的結(jié)構(gòu)中,應(yīng)包括有克隆和表達(dá)所需要的全部信號(hào)及DNA順序,基因密碼的閱讀框架也應(yīng)該同表達(dá)體系相適應(yīng)。此外,由于不同種類(lèi)的生物體或密碼子的使用都具有明顯的選擇性,在基因合成和克隆時(shí)必須考慮這個(gè)問(wèn)題。選擇合適的密碼子,以獲得表達(dá)。
 

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